细胞核中的丙酮酸脱氢酶复合体在高糖引起的胰岛素分泌障碍中的作用机制

细胞核中的丙酮酸脱氢酶复合体在高糖引起的胰岛素分泌障碍中的作用机制

【摘要】目的探讨细胞核中的丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）在高糖引起的β细胞胰岛素分泌障碍中的作用机制。方法设立空白组、对照组（5.5mmol/L）和高糖组（33.3mmol/L）培养β-TC6细胞72h。采用丙酮酸脱氢酶（E1）活性检测试剂盒检测各组β-TC6细胞中E1活性。E1-siRNA转染细胞后，采用ELISA法检测各组核内乙酰辅酶A的变化情况；ChIP-qPCR法检测各组Islet1、Ins、Pdx1基因表达水平；Western blot法检测各组ISLET1、INS、PDX1蛋白表达水平。结果与对照组相比，高糖组β-TC6细胞E1活性降低，间接表明PDC 受损（P <0.05）；采用E1-siRNA处理后，核内乙酰辅酶A的生成量明显减少（P < 0.05）；细胞内的Islet1、Ins和Pdx1基因表达和蛋白水平均降低（P< 0.05）。结论高糖会引起PDC损伤，造成核内乙酰辅酶A生成减少，胰岛素及其分泌相关基因和蛋白水平降低，导致胰岛素分泌障碍。

【关键词】丙酮酸脱氢酶复合体；高糖；乙酰辅酶A；乙酰化；胰岛素分泌障碍

Mechanism of pyruvate dehydrogenase complex in nucleus in insulin secretion disorder caused by high

glucose

【Abstract】Objective: To investigate effect of pyruvate dehydrogenase complex (PDC) in the nucleus on insulin secretion deficiency of β-TC6 cells induced by high glucose condition. Methods:β-TC6 cell was cultured with blank group, control group (5.5mmol/L) and high glucose

group (33.3mmol/L) for 72 hours. Pyruvate dehydrogenase (E1) activity was analyzed by its kit. Acetyl-CoA in the nucleus of β-TC6 cell transfected with E1-siRNA was measured by ELISA kit. The expressions of Islet1, Ins and Pdx1 gene were detected by ChIP-qPCR. Their levels of proteins were analyzed by Western blot. Results:E1 of β-TC6 cell reduced under high glucose load (P <0.05). The amount of acetyl-CoA decreased after β-TC6 cell was transfected with EI-siRNA (P < 0.05). The gene expression and their protein levels of Islet, Ins and Pdx1 were significantly inhibited (P < 0.05).Conclusion:High glucose condition will cause damaging of PDC, decreasing production of acetyl-CoA, suppressing expression of Islet, Ins and Pdx1 gene and their proteins, which lead to insulin secretion deficiency.

【Key words】Pyruvate dehydrogenase complex; Acetyl-CoA; High glucose; Insulin secretion disorder

丙酮酸脱氢酶复合体（Pyruvate Dehydrogenase Complex, PDC）是一种催化丙酮酸脱羧反应的多酶复合物，由丙酮酸脱氢酶（E1）、二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2）、二氢硫辛酸脱氢酶（E3）和六种辅助因子组成[1]。其活性的调控主要通过E1的磷酸化和去磷酸化来实现[2]。

过去认为PDC在哺乳动物体内仅存在于线粒体中，作为线粒体基质内的重要的多酶复合物，利用饮食中的碳水化合物生成乙酰辅酶A产生能量[3]。但有研究发现PDC同样参与了细胞核内乙酰辅酶A的

生成，而在细胞核中，PDC参与生成乙酰辅酶A是为了实现组蛋白乙酰化[4, 5]。Chakrabarti[6]等研究阐述了组蛋白乙酰化在调控胰岛素基因的表达中的重要作用，并发现胰岛β细胞胰岛素基因启动子邻近区域的组蛋白H3乙酰化水平明显升，与糖尿病的发生关系密切[7]。同时Bajotto[8]和Wu[9]等发现2型糖尿病的发生发展伴随着PDC活性下降，并与胰岛素抵抗呈平行性改变[9]。由此我们猜测PDC可能参与了胰岛β细胞核中乙酰辅酶A的生成及其组蛋白的乙酰化，进而影响胰岛素分泌及其相关基因和蛋白的表达。目前还没有相关研究能够证明高糖引起的胰岛素分泌障碍[11, 12]与上述过程有关。因此，本研究以PDC为切入点，探讨核内的PDC在高糖引起的胰岛素分泌障碍中的作用机制，为二型糖尿病的预防与治疗找到新的视角。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

小鼠β-TC6胰岛β细胞系（购买于中国科学院上海细胞库）；DMEM 高糖培养基、PBS（以色列Biological Industries公司）、FBS和胰蛋白酶（Gibco公司）；Lipofectamine2000转染剂（Invitrogen公司）；RT-PCR试剂盒、引物（上海生工）；E1活性检测试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）；ELISA试剂盒（美国eBioscience公司）；CHIP Assay Kit（Millipore 17-245RF）；快速DNA产物纯化试剂盒和UltraSYBR Mixture（Low ROX）（康为世纪）；Anti-Histone H3 (acetyl K27)、ISLET1、INS、PDX-1抗体（英国Abcam公司）；HRP标记的山羊抗兔抗体ΙgG二抗（美国Proteintech公司）；苯甲基磺酰氟