糖类物质分析测定

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(8)次甲基蓝本身也是一种氧化刑，其氧化型为蓝色， 还原型为无色；但在测定条件下它的氧化能力比 Cu2＋弱，故还原糖先与Cu2＋反应，Cu2＋完全反 应后，稍微过量一点的还原糖则将次甲基蓝指示剂 还原，使之由蓝色变为无色，指示滴定终点。
(9)为消除氧化亚铜沉淀对滴定终点观察的干 扰，在碱性酒石酸铜乙液中加入少量亚铁氰 化钾，使之与Cu20生成可溶性的无色络合物， 而不再析出红色沉淀。
(2)滴定过程应该始终保持在微沸状态下进行。沸腾 后继续滴定至终点的毫升数应控制在0．5～l mL内， 否则应重新测定。
(3)样品液中还原糖浓度不宜过高或过低，根据预备 试验结果，应将样品液稀释至还原糖的含量在1％ 左右为宜。
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(4)滴定至终点蓝色褪去之后，就不应再滴定，因 四甲基蓝指示剂被还原褪色后，当接触空气时， 又会被氧化重现篮色。
。
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糖类的定量测定有物理方法和化学方法 等多种。
物理方法又有折光法、旋光法、比重法 等。
化学方法主要利用还原糖的还原性， 用氧化还原法和比色法进行测定，应用较 普遍的有廉—爱农法、高锰酸钾容量法、 碘量法等。容量分析法目前仍是糖类测定 中普遍应用的方法。
还原糖的测定是测定的重点。
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二、还原糖的测定（Folin-热滴 定）
1．原理 斐林试剂由甲、乙液组成，甲液为硫
酸铜溶液，乙液为氢氧化钠与酒石酸钾 钠镕液。平时甲、乙液分别贮存，测定 时才等体积混合，混合时，硫酸铜与氢 氧化钠反应，生成氢氧化钢沉淀：
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生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钾钠反 应，生成酒石酸钾钠与铜的络合物，使 氢氧化铜溶解：
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(3)正式滴定
准确吸取斐林甲、乙液各5mL，置入150mL锥 形瓶中，加入V1mL试样稀释液和(Vz—1)mL 标准葡萄糖液，摇匀后加热煮沸，在沸腾状态 下以每两秒一滴的速度滴入标准葡萄糖液，至 蓝色刚好褪去为终点。
重复测定两份，取总消耗标准葡萄糖液体积 的平均值VmL。
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(2)预备试验
准确吸取斐林甲、乙液各5mL，置入150 mL锥形瓶中，加入V1mL试样稀释液(合 葡萄糖量约为5—15mg)及适量的0.1％标 准葡萄糖液，摇匀后加热煮沸， 在沸腾 情况下以每两秒一滴的速度滴入标准葡萄 糖液，至蓝色刚好消失为终点。记录消耗 标准葡萄糖液的总体积V2mL。
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(10)碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别储存，用时混合， 否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢 慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。
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反应终点本来应为氧化亚铜的红色，但 在改良的廉—爱农法中，在斐林乙液中 预先加入了亚铁氰化钾，使红色氧化亚 铜与亚铁氰化钾生成可溶性的复盐，反 应终点由蓝色转为浅黄色，更易观察；
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2．试剂
(1)、斐林试剂
甲液：称取35g硫酸铜(CuSO4·5H2O)，0.05g 四甲基蓝，用水溶解并解释至l000mL。
(5)斐林溶液与还原糖之间的反应因受溶液碱性、
加热湿度和时间以及副反应等影响，而没有严格
的定量关系，不能由当量定律来求出试样中还原
糖的含量，只能根据在相同实验条件下消耗相应
的标准还原糖量或由严格相同的实验条件下得出
的还原糖检索表上查得相应的还原糖量来进行计
算。所以用廉—爱农法定糖时，必须先用相应的
标准还原糖标定斐林溶液。
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乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液：它是利 用乙酸锌与亚铁氰化钾反应生成的亚铁 氰酸锌沉淀来挟走或吸附干扰物质。这 种澄清剂除蛋白质能力强，但脱色能力 差，适用于色泽较浅，蛋白质含量较高 的样液的澄清，如乳制品、豆制品等。
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硫酸铜和氢氧化钠溶液： 一般是用硫酸 铜溶液和氢氧化钠溶液组成的混合液进 行澄清，在碱性条件下，铜离子可使蛋 白质沉淀，适合于富含蛋白质的样品的 澄清。
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(1)含脂肪的原料
通常需鲜脱脂后再以水进行提取。一般 以石油醚处理一次或几次，必要时可加 热；每次处理后，倾去石油醚层(如分层 不好，可以进行离心分离)，然后用水提 取。
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（2）含有大量淀粉和糊精
通常使用70％一75％的乙醇溶液进行提取。因为 单独用水提取，会使样品中部分淀粉和糊精溶出或 吸水膨胀，影响分析测定，同时过滤也困难。操作 时，要求乙醇溶液的浓度应高到足以使淀粉和糊精 沉淀，若样品合水量较高，混合后的最终浓度应控 制在上述范围内。提取时，可加热回流，然后冷却 并离心，倾出上清液，如此提取2—3次，合并提 取液，蒸发除去乙醇。
第六章、糖类的测定
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糖类是微生物的主要碳源。发酵生产中使 用的糖类形式很多，使用最多的单糖是葡萄 糖和果糖，是含有六个碳原子的多羟基醛或 多羟基酮类，具有还原性。
发酵工业中应用最多的双糖是蔗糖和麦芽 糖，发酵工业中应用最多的糖类原料是淀粉。 糖类的测定在生产中非常重要，通过糖类的 测定可以知道原料中淀粉的含量，了解发酵 过程糖类消耗的情况，以及测定某些成品如 淀粉酶、糖化酶的活力等。
影响分析结果的准确性；胶态杂质的存在还会
给过滤操作带来困难，因此必须把这些干扰物
质除去。常用的方法是加入澄清剂沉淀这些干
扰物质。
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(1)对澄清剂的要求
澄清剂的作用是沉淀一些干扰物质 能完全地除去干扰物质。 不吸附或沉淀被测糖分，也不改变被测
糖分的理化性质(如比旋光度等) 过剩的澄清剂应不干扰后面的分析操作，
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4．计算
式中 V0——标定斐林溶液各5mL消耗标准葡 萄糖溶液的体积(mL)
V——正式滴定消耗标准葡萄糖溶液的体积 (mL)
C——标准葡萄糖溶液的浓度(g／mL) Vl——测定时加入试样稀释液的体积(mL) n——试样稀释倍数
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5.说明
(1)滴定速度、锥形瓶壁厚度和热源的稳定程度等， 对测定精密度影响很大。平行测定的滴定毫升数相 差不应超过0.1mL，故在标定、预备、正式测定过 程中，实验条件应力求一致。
乙液：称取117g酒石酸钾钠，126.4g氢氧化 钠 ． 9.4g 亚 铁 氰 化 钾 ， 用 水 溶 解 并 稀 释 至 l000mL。
( 2)、0.1％标准葡萄糖溶液 精密称取1.0000g经 95～105℃烘干的无水葡萄糖，用少量水溶解， 移入l000ml容量瓶中，加入5mL盐酸，用水稀 释至刻度，摇匀。
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此外，可作为可溶性糖类提取液的澄清剂的还 有碱性乙酸铅、氢氧化铝溶液和活性炭。但碱 性乙酸铅与杂质作用生成体积甚大的沉淀，可 带走还原糖，特别是果糖，而且，过量的碱性 乙酸铅可因其碱度及铅糖的形成而改变糖类的 旋光性；氢氧化铝溶液只能除去胶态杂质，澄 清效果差；活性炭吸附能力较强，能吸附糖类 造成损失。这些缺点限制了它们在糖类分析上 的应用。
(6)为避免糖类被酶水解的现象发生，可加 入氯化汞。
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2．提取液的澄清
提取液除含有可溶性糖类外，还不同程度地
含有一些影响分析检测的杂质，如色素、蛋白
质、果胶、淀粉、有机酸、氨基酸、单宁等，
这些物质的存在常会使提取液带有颜色，或呈
现混浊，影响测定终点的观察；也可能在测定
过程中与被测成分或分析试剂发生化学反应，
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用乙酸锌—亚铁氰化钾溶液做澄清剂时， 用量一般是50一75m1样品溶液加入乙酸 锌—亚铁氰化钾溶液各5ml。
用硫酸铜—氢氮化钠溶液作为澄清剂时， 一般在50一75m1样品溶液中加入10m1 硫酸铜溶液和4m1氢氧化钠溶液。
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3．样品溶液除铅
澄清后的样品溶液中残留铅离子在加热样品 溶液时，铅能与还原糖(特别是果糖)结合生成铅 糖化合物，结果使测得的还原糖含量降低。因
此，样品溶液必须除铅。
常用的除铅剂有草酸钠、草酸钾、硫酸钠、
磷酸氢二钠等。使用时可以固体状态加入，如
草酸钠，也可以液体状态加入。但应注意，如
用固体除铅剂，应先将样品溶液定量到一定体
积后再加入；如用液体除铅剂，应在加入除铅
剂后再定容。除铅剂的用量也要适当，在保证
使铅完全沉淀的前提下，尽量少用。
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(6)此法所用的氧化剂碱性酒石酸铜的氧化能力较 强，醛糖和酮糖都可被氧化，所以测得的是总还 原糖量。
(7)本法是根据经过标定的一定量的碱性洒石酸铜 溶液消耗的样品溶液量来计算样品溶液中还原糖 的含量，反应体系中Cu2＋的含量是定量的基础， 所以在样品处理时，不能使用铜盐作为澄清剂， 以免样品溶液中引入Cu2＋，得到错误的结果。
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第一节、还原性糖的测定
一、可溶性糖类取和澄清 食品中的可溶性糖通常是指葡萄糖、果 糖及蔗糖。测定可溶性糖时一般须选择 适当的溶剂提取，并对提取液进行纯化， 排除干扰物质，然后才能测定。
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1、提取
从样品中提取可溶性糖类常用水和乙 醇溶液做提取剂，制备提取液的方法要 根据样品的性状而定，通常可遵循以下 原则。
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3．测定步骤
(1)斐林溶液的标定
准确吸取斐林甲、乙液各5ml．置入150mL锥形 瓶 中 ， 加 水 10mL ， 从 滴 定 管 中 预 先 加 入 约 20mL0.1％的标油葡萄糖溶液(用量控制在后滴 定消耗0．1％标准葡萄糖1mL以内）．摆匀。 于电炉上加热至沸，在沸腾状态下以每两秒一 滴的速度滴入标准葡萄糖液，至蓝色刚好消失 为终点，记录前后总共消耗的标淮葡萄糖液的 总体积。同法平行操作三份，取接近的两次体 积的平均值。
或易于除掉。
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（2）常用的澄清剂
中性乙酸铅：铅离子能与很多离子结合，生成 难溶解的沉淀物，它能除去蛋白质、果胶、有 机酸、单宁等杂质，同时还能吸附除去部分胶 体杂质。不会沉淀样品溶液中的还原糖，在室 温下也不会形成可溶性的铅糖化合物，适用于 测定还原糖样品溶液的澄清。但它的脱色能力 较差，不能用于深色样液的澄清，它适用于植 物性样品、浅色的糖及糖浆制品、果蔬制品、 烘烤制品等。
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酒石酸钾钠铜络合物中的二价铜是一个 氧化剂，能使还原糖氧化，而二价铜被 还原成一价的红色氧化亚铜沉淀：
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反应终点用次甲基蓝指示剂显示。次 甲基蓝是氧化能力较二价铜更弱的一种 用氧化剂，故待二价铜全部被还原糖还 原后，过量一滴还原糖立即使四甲基蓝 还原．溶液的蓝色即消失：
在70％一75％的乙醇溶液中，蛋白质不会溶解
出来，因此，提取液不含除蛋白质。
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（3）含乙醇和二氧化碳的液体 样品
通常蒸发至原体积的1／3—1／4，以 除去乙醇和二氧化碳。但若样品为酸件 食品，在加热前应预先用氢氧化钠调节 样品溶液的pH值至中性，以防止低聚糖 在酸性条件下被部分水解。
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澄清剂应根据样品溶液的种类、干扰成分的种 类及含量加以适当的选择，同时还必须考虑到 所采用的分析方法。
如用直接滴定法测定还原糖时不能用硫酸 铜—氢氧化钠溶液澄清样品，以免样品溶液中 引入铜离子；
用高锰酸钾滴定法测定还原糖时，不能用乙 酸锌—亚铁氰化钾溶液澄清样品溶液，以免样 品溶液中引入锌离子。
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（4)提取固体样品
可采用加热的方法以提高提取效果，加 热温度一般控制在40一50℃，一般不超 过80℃，温度过高时可溶性多糖会随之 溶出，增加下步澄清工作的负担。用乙 醇做提取剂，加热时应安装回流装置。
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（5）水果及其制品的提取掖应控制在中性。 因为水果中含有有机酸，在酸性条件下 加热会发生水解。
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(3)澄清剂的用量
通常避免使用过量的澄清剂。用量太 少，固然达不到澄清的目的，但用量太 多，则会使分析结果产生误差。另外， 不同的样品溶液因于扰物质的种类和含 量不同，所需加入澄清剂的量也不同。
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中性乙酸铅作为澄清剂
一般先向样品溶液中加入1—3m1乙酸铅饱 和溶液(约30％)，充分混合后静置15min，向 上层清波中加入几滴中性乙酸铅溶液，上层清 液中没有新的沉淀形成，说明杂质已沉淀完全， 如有新的沉淀形成，就再混匀并静置几分钟， 如此重复直至无沉淀形成为止。也可以用20％ 中性乙酸铅溶液。