实时荧光定量PCR技术详解及总结
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荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
定量原理
• 浓度的对数值与循环数呈 线性关系，根据样品扩增 达到域值的循环数（Ct值） 就可分析样品中起始模板 量
定量PCR的实验步骤
1 标准菌株DNA的提取 2 QPCR探针和引物的设计 3 阳性克隆质粒的构建 4 荧光定量PCR反应 5 定量标准曲线 6 重复性实验 7 灵敏性实验
实时荧光定量PCR技术详解及总 结
目录 • 实时定量PCR基本原理 • 实时定量PCR实验材料 • 实时定量PCR实验方法 • 实时定量PCR实验结果
实时定量PCR基本原理
1 实时定量PCR的定义 2 实时定量PCR标准曲线
实时定量PCR的定义
• 定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精 确的对起始模板的定量分析
定量PCR三个基本概念
Biblioteka Baidu• 扩增曲线
背景期
指数增 长期
平台期 线性增长期
阈值与C(t)值
• 阈值：是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的 10倍，设定在扩增曲线指数增长期
• C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增 循环次数
C(t) value
Threshold line
C(t) value
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
• 将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：
log X0= (- log(1+Ex) ) ×C(t)+ log Xc(t)
初始浓度的对数与循环数呈线性关系
实时定量PCR标准曲线
• 初始模板量越多，C(t)值越小 C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系
实验材料
结语
谢谢大家！
18.12 +/- 0.04
定量PCR的数学原理
• 理想的PCR反应： Xn=X0×2n
• 非理想的PCR反应： Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
定量原理
• 浓度的对数值与循环数呈 线性关系，根据样品扩增 达到域值的循环数（Ct值） 就可分析样品中起始模板 量
定量PCR的实验步骤
1 标准菌株DNA的提取 2 QPCR探针和引物的设计 3 阳性克隆质粒的构建 4 荧光定量PCR反应 5 定量标准曲线 6 重复性实验 7 灵敏性实验
实时荧光定量PCR技术详解及总 结
目录 • 实时定量PCR基本原理 • 实时定量PCR实验材料 • 实时定量PCR实验方法 • 实时定量PCR实验结果
实时定量PCR基本原理
1 实时定量PCR的定义 2 实时定量PCR标准曲线
实时定量PCR的定义
• 定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精 确的对起始模板的定量分析
定量PCR三个基本概念
Biblioteka Baidu• 扩增曲线
背景期
指数增 长期
平台期 线性增长期
阈值与C(t)值
• 阈值：是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的 10倍，设定在扩增曲线指数增长期
• C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增 循环次数
C(t) value
Threshold line
C(t) value
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
• 将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：
log X0= (- log(1+Ex) ) ×C(t)+ log Xc(t)
初始浓度的对数与循环数呈线性关系
实时定量PCR标准曲线
• 初始模板量越多，C(t)值越小 C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系
实验材料
结语
谢谢大家！
18.12 +/- 0.04
定量PCR的数学原理
• 理想的PCR反应： Xn=X0×2n
• 非理想的PCR反应： Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率