微生物学实验讲义

微生物学实验讲义．

实验四显微测微技术及细菌运动性观察

一、目的要求

1．了解测微尺的构造和使用，学会测量微生物细胞大小的方法。

2．学习悬滴法观察细菌运动性技术

二、实验原理

(一) 显微测微技术

微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。其大小的测量需在显微镜下用目镜测微尺来进行，但由于测量的是放大后的图像，故目镜测微尺在不同放大倍率下每格实际代表的长度也随之变化，因此，需用物镜测微尺来校正在不同放大倍率下目镜测微尺每格所代表的实际长度。

物镜测微尺是中央刻有精确刻度的载玻片，一般是将1 mm等分为100格，每格长0.01 mm，即10 pm，它不直接用于测量细胞大小，而是用于校正目镜测微尺的每格的相对长度。目镜测微尺是一个可放人接目镜的直径均为1.75 mm 的圆形玻片，其中央有精确的等分刻度(有50格和100格两种)测量时，需将

其放人接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。

(二) 细菌运动性

在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以辨别。

三、实验器材

1．活材料：培养12-16h的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母

2．试剂：香柏油、二甲苯、凡士林等。

3．器材：目镜测微尺，物镜测微尺、凹载玻片、盖玻片、镊子、接种环、滴管、擦镜纸、显微镜。

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四、操作步骤

(—) 显微测微技术

1．装目镜测微尺：取出接目镜，把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目

镜镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插人镜筒内。

2．校正目镜测微尺

(1) 将物镜测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上

(2) 先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，

当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺刻度与物镜测微尺的刻度平行。利用移动器移动物镜测微尺，使两尺的第一条刻度线相重合，再向右寻找另外两条重合的刻度线，分别数出两重合线之间物镜测微尺和目镜测微尺所占的格数，由下列公式算出目镜测微尺每格所代表的长度。

目镜测微尺每格长度＝( 两测微尺重合线间镜台测微尺格数10) / 两测微尺重合?线间目镜测微尺格数

用同样的方法换成高倍镜进行校正，记录并计算在每种倍率下目镜测微尺每一格所代表的长度。

(3) 酵母细胞大小的测定

目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上酵母水浸片，在不同倍率下测量菌体的长度和宽度，记录测定值，并计算出酵母的长、宽值。(5-10

个取平均)

(二) 悬滴法观察细菌运动性

1．在洁净盖玻片周围涂少许凡士林。

2．在盖玻片中央滴一小滴菌液，或用接种环取1-2环菌液置于中央。

3．将凹玻片反转，使凹窝中心对准盖玻片上的菌液滴，液滴不得与凹玻片接触，

以接种环柄轻压使盖玻片与凹玻片粘在一起，液滴处于封闭的小室中，防止液滴干燥和气流的影响。

4．小心将凹玻片翻转过来，使菌滴仍悬浮在盖玻片下和凹窝中心。

5．先用低倍镜找到悬滴边缘，再用高倍镜观察。观察时光线要调得暗一些。

用悬滴法分别观察大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的运动性。细菌的运动有一定的前进方向，并可转弯，极生单鞭毛菌类多为直线运动，周生鞭毛菌类多作波浪式运动。

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五、注意事项

1．检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运动2．制水封片时菌液不可加得太多，过多的菌液会在盖玻片下流动，因而在视野内只见大量的细菌朝一个方向运动，从而影响了对细菌正常运动的观察。

六、实验结果

1．报告测微计算过程与结果。

2．描述各菌运动方式。｜

七、思考题

1．为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？

2．在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小，测定结果是否相同？为什么？

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实验五酵母菌个体、群体形态观察，血球板显微镜计数技术

一、目的要求

1．学会使用显微镜观察酵母菌形态的方法。

2．观察并掌握酵母菌的菌落特征、个体形态、生长及繁殖方式。

3．学会区别死活菌的方法。

4．了解血球计数板计数的原理，学会测定酵母细胞总数方法。

二、实验原理

用血球计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。血球计数板是一块特制的厚载玻片，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横

槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，

中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分

成16个中方格，每个中方格又分成25个小格(即16×25)，另一种是一个大方格分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格(即25×16)，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的2，盖1 mm个，每一个大方格边长为1 mm，则每一个大方格的面积为小方格都是4003。，所以计数室的容积为

0.1 mm上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm计数时，如果使用16×25的计数板，要按对角线方位取左上、左下、右上、右下上述4个中格进行计数(即计数100个小格中的酵母细胞数)，如果使用25×16规格的计数板，则除了计数上述4个中格外，还要计数中央的1个中格，即计数80个小格中的

酵母细胞数，分别按下述公式计算出酵母细胞数。

(1) 16×25格的血球计数板计算公式：1 mL酵母细胞数=A/4×16×104

×稀释倍数

稀释倍数酵母细胞数= A/5×25×104×16 (2) 25×格的血球计数板计算公式：1mL

三、实验器材啤酒酵母菌悬液，显微镜，血球计数板，载玻片，盖玻片，接种环，吕氏美蓝染液。

四、操作步骤血球板计数(一)

10～．菌悬液的制备：为便于计数，对样品进行适当稀释，稀释程度以每小格内含15 5

个酵母为宜，可采用10倍系列稀释法。

2．加菌悬液样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管

将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液。

3．显微镜计数：加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，

先用低倍