产淀粉酶细菌的筛选和选育 - 副本

微生物学实验报告

第二模块

产淀粉酶细菌的筛选和选育

学院：生命科学学院

班级：09级4班

姓名：**

学号：09090340

产淀粉酶细菌的筛选和选育

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生命科学学院 09级4班

【摘要】从土壤中筛选、鉴定产淀粉酶菌株,并对菌株的分离筛选及诱变育种进行了研究。利用淀粉平板透明圈法，从土壤中初步筛选出10株产淀粉酶菌株,通过比较淀粉酶菌落大小(C) 和水解圈大小(H)

的比值,筛选出1株产淀粉酶活力较强的菌株。依据菌种形态、生理生化特征和16SrDNA序列分析，将其鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。

【关键词】淀粉酶分离鉴定诱变育种

淀粉酶是能催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一类酶的总称[1] 。淀粉酶类大约占据了25 %的酶市场[2] ,在淀粉糖工业、食品工业、纺织工业、造纸工业以及酿酒行业中被广泛应用,几乎完全取代了淀粉加工中淀粉的化学水解[3]。淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α- 淀粉酶为内切酶，以无规则的方式切开淀粉分子内部的α-1，4糖苷键，而使淀粉生成糊精和低聚糖，是一种钙离子依赖性酶。β-淀粉酶从非还原性末端顺次切下麦芽糖，为外切酶。葡萄糖淀粉酶是一种作用于α-1，4糖苷键的外切酶，从非还原糖末端切下葡萄糖分子。[4]诱变育种已成为菌种选育研究中最常采用的研究手段，近年来，原生质体融合，代谢调控，基因工程等较为定向的诱变育种方法出现，但这些方法成功用在生产上的例子很少。而紫外诱变育种仍为最广泛采用的诱变育种方法，它不仅可以提高菌株的生产能力，而且还可以改进产品质量，扩大生产，

简化工艺；同时，它还具有速度快，收效显著和方法简便等优点，因此在科学实验和生产上都得到了广泛的应用。本试验应用淀粉平板透明圈法，筛选出了1株产淀粉酶较高的菌株，并对菌种的分离鉴定及紫外诱变育种进行了研究，探讨了该突变株的产酶最适培养条件，为生物工程和淀粉酶工程寻求了更为高效、经济的方法。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 菌种来源：筛选的土样采自南京师范大学北区37幢宿舍外绿化带。

1．1．2 培养基

1.1.

2.1产淀粉酶菌筛选培养基：淀粉培养基

采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉，即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉3g溶于1000mL蒸馏水中，再加入20g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌20min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板。

1.1.

2.2分离培养基：淀粉培养基

采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉，即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉3g溶于1000mL蒸馏水中，再加入20g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌20min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板。

1.1.

2.3液体摇瓶发酵培养基

1 牛肉膏+蛋白胨，pH 7 30℃培养

配方：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g,pH 7

2 牛肉膏+蛋白胨，pH 7 室温(20℃)培养

配方：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g,pH 7

3 牛肉膏+柠檬酸钠

配方：牛肉膏3g，柠檬酸钠10g,葡萄糖3g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL

4 牛肉膏+硝酸钠

配方：牛肉膏3g，硝酸钠10g，葡萄糖3g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL

5 牛肉膏+蛋白胨，pH 4

牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g,pH 4

1．1．3 实验材料

无菌培养皿、无菌吸管、无菌离心管、电子天平、记号笔、玻璃涂棒、酒精灯、火柴、滤纸片、摇床、分光光度计、革兰氏染色全套试剂，载玻片，酒精灯，接种环，光学显微镜；

PCR反应试剂：Taq酶，反应缓冲液，dNTP，16S rRNA 基因上下游引物，模板（菌落）；

琼脂糖，溴化乙锭，凝胶电泳仪，水平电泳槽，紫外检测灯，TAE电泳缓冲液；

微量移液枪，枪头，PCR管，PCR仪。

试管、移液管、锥形瓶、量筒、烧杯、20 W 紫外灯、磁力搅拌器、离心机等

1．2 方法

1．2．1产淀粉酶细菌的分离

称取取样土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，振荡5min，静置5-10min。取上述10-1稀释度的土壤悬液1ml加入灭菌离心管中，在80℃水浴锅中水浴10min，在1.5ml灭菌离心管中依次稀释至10-2、10-3、10-4稀释度。取上述10-2、10-3、10-4稀释度的菌悬液分别涂布平板。 30 ℃培养，24小时。

用记号笔标记6个单菌落，用灭菌牙签挑取单菌落依次放入6个已编号盛有1ml生理盐水的1.5ml离心管中。在原平板上菌落周围滴加路哥氏碘液，测量菌落大小(C) 和水解圈大小(H) 。挑选H/ C 的值最大产淀粉酶的菌，在一块平板中划线分离。培养24小时后，在进行下次实验之前提前24h平板菌种接液体试管活化，并接种一支斜面试管保藏。

1．2．2菌种的摇瓶培养与不同培养条件的影响

提前3h按0.5％接种量分别转接如下五种液体摇瓶发酵培养基。

1 牛肉膏+蛋白胨，pH 7 30℃培养

2 牛肉膏+蛋白胨，pH 7 室温(20℃)培养

3 牛肉膏+柠檬酸钠 30℃培养

4 牛肉膏+硝酸钠 30℃培养

5 牛肉膏+蛋白胨，pH 4 30℃培养

1．2．2．1不同条件对淀粉酶活性的影响测定

每组制备淀粉培养基平板一块。培养基倒入量要求不要太多，尽量薄一点，铺满平板底部即可。

用小滤纸片分别蘸取各瓶培养物少许（要求：不要蘸太多，保证每片所蘸培养物尽量一致）

如下图所示，将滤纸片贴在淀粉培养基表面，并分别在底板上做上标记。

将平板置于30 ℃培养箱培养1h。然后将碘液铺在平板上，观察并测量水解圈的大小。

1．2．2．2不同条件对菌体生长量影响的测定

将培养18h后液体摇瓶培养物分别取出3mL于比色杯中，在721型分光光度计600nm波长下测定吸光值(optical density，OD600值)。如果菌液浓度过大，可做适当稀释后再进行测量，保证OD值应控制在0.1-1之间。分别记录各种不同培养基和不同培养条件下OD600值大小，评价对菌体生长量的影响。

1．2．3形态学的鉴定

观察平板菌落的大小、颜色等特征,

细菌形态镜检，革兰氏染色鉴定