产淀粉酶细菌的筛选和选育 - 副本

微生物学实验报告
第二模块
产淀粉酶细菌的筛选和选育
学院：生命科学学院
班级：09级4班
姓名：**
学号：09090340
产淀粉酶细菌的筛选和选育
**
生命科学学院 09级4班
【摘要】从土壤中筛选、鉴定产淀粉酶菌株,并对菌株的分离筛选及诱变育种进行了研究。

利用淀粉平板透明圈法，从土壤中初步筛选出10株产淀粉酶菌株,通过比较淀粉酶菌落大小(C) 和水解圈大小(H)
的比值,筛选出1株产淀粉酶活力较强的菌株。

依据菌种形态、生理生化特征和16SrDNA序列分析，将其鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。

【关键词】淀粉酶分离鉴定诱变育种
淀粉酶是能催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一类酶的总称[1] 。

淀粉酶类大约占据了25 %的酶市场[2] ,在淀粉糖工业、食品工业、纺织工业、造纸工业以及酿酒行业中被广泛应用,几乎完全取代了淀粉加工中淀粉的化学水解[3]。

淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。

α- 淀粉酶为内切酶，以无规则的方式切开淀粉分子内部的α-1，4糖苷键，而使淀粉生成糊精和低聚糖，是一种钙离子依赖性酶。

β-淀粉酶从非还原性末端顺次切下麦芽糖，为外切酶。

葡萄糖淀粉酶是一种作用于α-1，4糖苷键的外切酶，从非还原糖末端切下葡萄糖分子。

[4]诱变育种已成为菌种选育研究中最常采用的研究手段，近年来，原生质体融合，代谢调控，基因工程等较为定向的诱变育种方法出现，但这些方法成功用在生产上的例子很少。

而紫外诱变育种仍为最广泛采用的诱变育种方法，它不仅可以提高菌株的生产能力，而且还可以改进产品质量，扩大生产，
简化工艺；同时，它还具有速度快，收效显著和方法简便等优点，因此在科学实验和生产上都得到了广泛的应用。

本试验应用淀粉平板透明圈法，筛选出了1株产淀粉酶较高的菌株，并对菌种的分离鉴定及紫外诱变育种进行了研究，探讨了该突变株的产酶最适培养条件，为生物工程和淀粉酶工程寻求了更为高效、经济的方法。

1 材料和方法
1．1 材料
1．1．1 菌种来源：筛选的土样采自南京师范大学北区37幢宿舍外绿化带。

1．1．2 培养基
1.1.
2.1产淀粉酶菌筛选培养基：淀粉培养基
采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉，即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉3g溶于1000mL蒸馏水中，再加入20g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌20min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板。

1.1.
2.2分离培养基：淀粉培养基
采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉，即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉3g溶于1000mL蒸馏水中，再加入20g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌20min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板。

1.1.
2.3液体摇瓶发酵培养基
1 牛肉膏+蛋白胨，pH 7 30℃培养
配方：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g,pH 7
2 牛肉膏+蛋白胨，pH 7 室温(20℃)培养
配方：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g,pH 7
3 牛肉膏+柠檬酸钠
配方：牛肉膏3g，柠檬酸钠10g,葡萄糖3g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL
4 牛肉膏+硝酸钠
配方：牛肉膏3g，硝酸钠10g，葡萄糖3g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL
5 牛肉膏+蛋白胨，pH 4
牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g,pH 4
1．1．3 实验材料
无菌培养皿、无菌吸管、无菌离心管、电子天平、记号笔、玻璃涂棒、酒精灯、火柴、滤纸片、摇床、分光光度计、革兰氏染色全套试剂，载玻片，酒精灯，接种环，光学显微镜；
PCR反应试剂：Taq酶，反应缓冲液，dNTP，16S rRNA 基因上下游引物，模板（菌落）；
琼脂糖，溴化乙锭，凝胶电泳仪，水平电泳槽，紫外检测灯，TAE电泳缓冲液；
微量移液枪，枪头，PCR管，PCR仪。

试管、移液管、锥形瓶、量筒、烧杯、20 W 紫外灯、磁力搅拌器、离心机等
1．2 方法
1．2．1产淀粉酶细菌的分离
称取取样土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，振荡5min，静置5-10min。

取上述10-1稀释度的土壤悬液1ml加入灭菌离心管中，在80℃水浴锅中水浴10min，在1.5ml灭菌离心管中依次稀释至10-2、10-3、10-4稀释度。

取上述10-2、10-3、10-4稀释度的菌悬液分别涂布平板。

30 ℃培养，24小时。

用记号笔标记6个单菌落，用灭菌牙签挑取单菌落依次放入6个已编号盛有1ml生理盐水的1.5ml离心管中。

在原平板上菌落周围滴加路哥氏碘液，测量菌落大小(C) 和水解圈大小(H) 。

挑选H/ C 的值最大产淀粉酶的菌，在一块平板中划线分离。

培养24小时后，在进行下次实验之前提前24h平板菌种接液体试管活化，并接种一支斜面试管保藏。

1．2．2菌种的摇瓶培养与不同培养条件的影响
提前3h按0.5％接种量分别转接如下五种液体摇瓶发酵培养基。

1 牛肉膏+蛋白胨，pH 7 30℃培养
2 牛肉膏+蛋白胨，pH 7 室温(20℃)培养
3 牛肉膏+柠檬酸钠 30℃培养
4 牛肉膏+硝酸钠 30℃培养
5 牛肉膏+蛋白胨，pH 4 30℃培养
1．2．2．1不同条件对淀粉酶活性的影响测定
每组制备淀粉培养基平板一块。

培养基倒入量要求不要太多，尽量薄一点，铺满平板底部即可。

用小滤纸片分别蘸取各瓶培养物少许（要求：不要蘸太多，保证每片所蘸培养物尽量一致）
如下图所示，将滤纸片贴在淀粉培养基表面，并分别在底板上做上标记。

将平板置于30 ℃培养箱培养1h。

然后将碘液铺在平板上，观察并测量水解圈的大小。

1．2．2．2不同条件对菌体生长量影响的测定
将培养18h后液体摇瓶培养物分别取出3mL于比色杯中，在721型分光光度计600nm波长下测定吸光值(optical density，OD600值)。

如果菌液浓度过大，可做适当稀释后再进行测量，保证OD值应控制在0.1-1之间。

分别记录各种不同培养基和不同培养条件下OD600值大小，评价对菌体生长量的影响。

1．2．3形态学的鉴定
观察平板菌落的大小、颜色等特征,
细菌形态镜检，革兰氏染色鉴定
按照《伯杰氏细菌鉴定手册》检索
1.2.4 菌株鉴定方法
测定菌株的生理生化特性，结合PCR扩增16s rDNA、16s rDNA序列测定、同源性比较确定其种属。

1.2.5 16S rDNA的PCR扩增和测序
菌液的DNA提取和纯化参照文献[5]，用于16s rDNA PCR反应的引物为一对通用引物，即正向引物为BSF8（5’- AAC TGA AGA GTT TGA TCC TGG CTC -3’），反向引物为BSR1541（5’- TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T -3’）。

反应体系：在一个PCR管中用微量移液枪依次加入列物质：
Taq buffer（10×） 2.5μl
MgCl2（25mM） 1 μl
dNTP（2.5 mM） 2.5 μl
Primer Forward（50 mM） 1 μl
Primer Reverse（50 mM） 1 μl
ddH2O 16.5 μl
用灭菌牙签挑取单菌落于PCR管中，使菌体悬浮于反应体系中。

rTaq（2U/μl） 0.5 μl
PCR反应条件：95℃预变性15 min后，95℃变性1 min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共25个循环，72℃延伸10min。

1.2.6 序列比对分析
使用NCBI 网站对待测菌的16SrDNA 序列与数据库中各种菌的
16SrDNA 序列进行比对。

登陆 美国国立生物技术信息中心网站，使用BLASTn 在GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB 基因库中进行同源性搜索。

从Genebank 中选择近与待测菌目的基因序列同源性最高的已知分类的菌株的16SrRNA基因序列, 初步确定待测菌的分类位置。

用Clustal软件将已知分类菌株的16SrRNA序列与待测菌的16SrRNA序列进行多序列比较。

1.2.7紫外诱变育种
活化：挑取一环活化菌株，接种至含10ml淀粉培养基的50ml三角瓶中，于25℃，150 r/min的摇床中振荡培养。

取出培养约16h 的摇瓶，取0.5ml菌悬液（吸取前三角瓶要摇匀）于离心管中（每组3管），5000 r/min离心5min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2次，加入1.5ml无菌生理盐水制成菌悬液。

紫外处理：取制备好的菌悬液3 mL 移入6 cm 的无菌培养皿中，将上述平皿置于紫外灯下的脱色摇床上，打开皿盖，距离紫外灯管 30cm，照射3min（单号排）或者6min（双号排），盖上皿盖。

稀释菌液：在超净台内，将照射后的菌悬液用无菌水按10倍稀释法依次稀释成10-1-10-5（在dorf管中进行）。

涂布平板：取10-3、10-4两个稀释度的菌悬液各0.1ml涂布均匀。

以同样的操作，取未经紫外线处理的菌悬液稀释涂布平板作为对照。

平板于37℃倒置培养48 h(用黑布包好平板)。

2 结果与分析
2．1 分离筛选
划线分离平板培养24小时后，平板形成白色菌落，菌落背面乳白色，形态不规则，质地较密，菌落边缘不整齐，表面粗，干燥
图1 划线分离平板
图2 划线分离平板
2．2 不同培养条件的影响
2．2．1不同条件对淀粉酶活性的影响
图3 不同条件对淀粉酶活性的影响
结论：从表中可以看出产淀粉酶菌在培养基：牛肉膏+蛋白胨，pH 7
培养条件：30℃培养情况下淀粉酶的活性最好。

2．2．2 不同条件对菌体生长量影响的测定
图4 液体摇瓶发酵培养基培养18h后液体摇瓶培养物
结论：比较OD600值可知该产淀粉酶菌在培养基：牛肉膏+蛋白胨，pH 7
培养条件：30℃培养情况下生长量最大；而在培养基：牛肉膏+蛋白
胨，pH 7 培养条件：20℃培养情况下基本不生长；在牛肉膏+柠檬
酸钠，30℃培养以及牛肉膏+硝酸钠，30℃培养的条件下基本不生长；
在牛肉膏+蛋白胨，pH 4的培养基上不生长。

2．3 产淀粉酶菌的形态学鉴定
淀粉酶产生菌株的形态为短杆状，无芽孢（由于培养时间关系），革兰氏染色阳性；菌落呈白色，菌落背面乳白色，形态不规则，质地较密，菌落边缘不整齐，表面粗，干燥。

图5
图5、图6 产淀
粉酶菌革兰氏
染色后在油镜
观察下的形态
图6
2．4 产淀粉酶菌16S rRNA分子鉴定结果并构建系统发育树：测得淀粉酶产生菌株16S rDNA序列有1421 个碱基, 将此序列在GenBank 中BLAST ,显示与短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）有较高的同源性
图7 产淀粉酶菌基于16S rDNA序列的系统发育树
2．5 淀粉酶产生菌的紫外诱变育种结果
紫外照射10-3对照10-3紫外照射10-4对照10-4
图8 紫外诱变组与对照组（已加碘液）
表3 对照组和紫外照射组平板菌落数
经计算后，紫外照射后，产淀粉酶菌株存活率约为41%，致死率约为59%
加碘液后，通过对比可以明显看出：经紫外诱变菌株产生的水解圈明显比对照组菌株产生的水解圈要大。

诱变后的H/C值约为 1.40，紫外诱变产生的正突变。

3 讨论
淀粉酶产生菌的筛选、培养与选育是功能微生物研究的基础技术，试验中菌种筛选及分离、纯化十分关键，对淀粉酶的产生十分重
要，如何筛选出高产淀粉酶的菌种是获得目标菌株的基础和前提，筛选菌种时，无菌操作又是非常重要的技术，高压灭菌对无菌操作也非常重要。

筛选出菌种后通过培养菌种的形态特征及16-sRNA 的序列分析可以确定菌种的类型，以便于以后的继续研究。

通过紫外诱变育种可以使酶的活性增强。

紫外诱变中最重要的一步就是在避光的条件之下进行实验，否则突变的DNA在光复酶的作用下修复，对菌落的突变会产生负面的影响。

淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。

淀粉酶种类繁多,特点各异,在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途[6]。

【参考文献】
[1]A sghar M, Asad MJ , Rehman S ,et al . A thermostableα-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing[J].Journal of Food Engineering ,2007 ,79 :950 - 955.
[2]Burhan A ,Nisa U ,Gokhan C ,et al . Enzymatic properties of
a novel thermo-philic , alkaline and chelator resistant amylase from an alkalophilic Bacillus sp.
Isolate ANT - 6[J] . Process Biochemistry ,2003 ,38 :1397 - 1403.
[3]Pandey A ,Nigam P ,Soccol C R ,et al . Advances in microbial
amylases[J ] .
Biotechnology and Applied Biochemistry ,2000 ,31 :135 - 152.
[4] 刘杰雄，陈号，陆雯，朱丽云。

淀粉酶高产菌株的筛选及其酶活的测定
[5]叶明亮，袁著忻，李晓娣等．细菌随机扩增多态性 DNA分析中模板提取方法的优化[J]．军事医学科学院院刊，2001， 25(2)：100—102．
[6]张双民.土壤中淀粉酶高产菌株的分离及产酶条件的优化.土壤肥
料，2006 02。