第三章 高效液相色谱分析

3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
由于液体的扩散系数比气体的小105倍，因此，溶质在 液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而 在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。
液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而 且回收是定量的，适合于大量制备。
第一节 概述 第二节 影响分离的因素与操作条件
的选择 第三节 主要分离类型与分离原理 第四节 液相色谱的固定相与流动相 第五节 高效液相色谱仪
第一节 概述
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经 典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液 相色谱法
一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别 三、高效液相色谱仪流程图 四、特点
1 流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）
u 1cm / s时，H u u H ，n 柱效 ，但tR 兼顾柱效和分析时间，选择u 1ml / min
2 涡流扩散项及其影响
A 2 dp
A dp
，dp A H ，n 柱效
3 传质阻力项及其影响
C Cm Csm Cs Cm Cs（m 忽略固定相传质阻力）
k=1~10 k=2~5 最理想的 3）与检测器匹配： UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长） 荧光，电化学 4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈） 使用前过滤、脱气
5 洗脱方式
1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似GC的等温度洗脱
四、HPLC的特点和应用
（1）高效：柱效达3万塔板/米以上； （2）高压：一般150~350×105pa; （3）高速：＜1小时； （4）高灵敏度：荧光检测器可达10-11g; （5）应用范围广：高沸点、热不稳定有机及生化试 样。（可分析80%有机化合物） （6）柱外效应较大，而气相色谱可以忽略； （7）尚缺乏灵敏度的通用型检测器，且成本较高。
2．流动相差别 ❖ GC：流动相为惰性气体 ➢ 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 ❖ HPLC：流动相为液体 ➢ 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 ➢ 流动相种类较多，选择余地广 ➢ 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
高效液相色谱
经典色谱
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大 优点在于高压、高速、高效、高灵敏度。
经典液相色谱法
高效液相色谱法
粒径(μm)
75-600
3-50（常用5-10）
柱前压力(atm)
0.01-1.0
20-300
分析时间 (h)
1-20
0.05-1.0
Hale Waihona Puke Baidu
色谱柱长度(cm)
50-200
2-30
一、HPLC与经典LC区别
✓ 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
1．经典LC：仅做为一种分离手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻力
忽略固定相传质阻力
HPLC：H A Cm u Csm u
Cm
Csm
dp 2 Dm
C dp2 Dm
Dm
T
dp C H ，n 柱效
Dm H ，n 柱效
T Dm C ，但易产生气泡
T Dm ， ，柱阻
4 对流动相的要求：
1）与固定液不反应 2）对样品有良好溶解度
二、HPLC与GC差别
✓ 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 ✓ 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
1．分析对象 GC：能汽化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测，占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制， 分子量大、难汽化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的 80%
High Performance Liquide Chromatography HPLC
教学基本要求
❖ 掌握高效液相色谱法的优点及适用范围； ❖ 了解高效液相色谱仪的主要部件及高效液
相色谱法的基本流程； ❖ 理解常用检测器原理、适用的分析对象及
适用范围； ❖ 理解各种分离方式的原理及选择原则。
第三章 高效液相色谱分析
第二节 影响分离的因素与操作条件的选择
一 影响分离的因素 二 分离条件的选择 三 分离类型的选择
一、影响分离的因素
影响分离的主要因素有流动相的流量、 性质和极性。
在高效液相色谱中, 速率方程中的分子 扩散项B/u较小，可以忽略不计，而只有两项 ，即：
H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不 同，如图所示：
液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂， 价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补 充的。
GC
HPLC
应用范围
热稳定、低沸点 热不稳定、高沸点、
的物质
离子型的物质
热力学理论
较成熟
正在发展中
分析成本
低
高
分离能力 与柱的类型有关
较高
三、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质） 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
柱效(块/m)
2-50
104-105
样品用量(g)
1-10
10-6-10-2
高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。 由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效 液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cm·min-1.例如分离苯的羟基化合物，7个组分只 需1min就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法， 柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高 效液相色谱法，只需lh之内即可完成。又如用 25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用 梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿样中104个组 分.