代谢工程重点整理

代谢工程重点整理
一、名词解释
1、柔性节点(flexible node)：若流入每一分支的流量容易改变以满足需求，这样的节点称为柔性节点。

（在柔性节点，导向每一分支的酶对节点代谢物的亲和性相近似，每个分支的反应速度也相近，每一分支的流量受相应的终端产物反馈抑制控制。

）
2、刚性节点：若一个节点的一个或多个分支的分配率被严密控制，则称该节点是强刚性的，即刚性节点。

（这种控制通常是通过反馈控制和一个代谢物对另一个分支的酶的交叉激活这两种作用的结合来实现的。

）
3、反馈抑制（feedback inhibition）：也称负反馈，这是生物体普遍存在的一种调节机制，反馈抑制是指反应终产物对自身合成途径中的酶活力起抑制作用，大多是对第一个酶的活力起抑制作用。

4、反馈阻遏：末端代谢产物阻止整个代谢途径酶的合成作用。

5、代谢组学：一门“在新陈代谢的动态进程中,系统研究代谢产物的变化规律,揭示机体生命活动代谢本质”的科学。

它所关注的是相对分子质量为1,000以下的小分子。

6、拟稳态假设：
7、超定系统和不定系统：AX(t)=0，如果方程数等于反应速率数目（代谢通量），方程有唯一确定解，称为正定系统。

如果方程数小于反应速率数目（代谢通量），方程有无数解或不确定解，称为不定系统。

如果方程数大于反应速率数目，称为超定系统。

如果已测量的通量的个数小于系统的自由度，刚对网络通量存在无数个解----不定系统，这时如果能够规定一个合适的目标函数（例如使比生长速率最大这样的目标函数），那么就能利用线性规划来确定胞内通量分布。

8、比较基因组学（Comparative genomics）：在基因组图谱和序列分析的基础上，对已知基因和基因的结构进行比较，了解基因的功能、表达调控机制和物种进化过程的学科。

9、基因尺度的代谢网络构建：代谢网络模型的构建包含有序地收集生物系统内所有基因、蛋白质、生物化学反应的信息的过程，然后通过系统限制条件用数学方程将重构信息表达出来，从而将信息转化为模型。

二、填空题
1、三条代谢途径
2、几个分支代谢途径及其调节
分支途径的调节：1、同功酶调节：催化相同反应，但酶分子结构有差异；
2、协同反馈抑制：一个不能少；
3、累积反馈抑制：按比例累加，无协同效应，无拮抗作用；
4、增效反馈抑制：1+1>2；
5、顺序反馈抑制：按①→②→③顺序逐步抑制；
6、联合激活或抑制调节：途径产物各自调节，同一中间产物；
7、代谢网络的调节。

3、填空计算题
答：PPT代谢工程-6.7。

4、微生物代谢途径的表达（酶表达水平的调节方式、酶活性的三种调节方式、反馈调节2种方式的划分）答：微生物代谢：分解代谢和组成代谢
细胞组成：蛋白质、核酸、脂质、多糖
组成代谢及相关发酵产物：氨基酸、核苷酸、脂肪酸
酶水平调节的两种主要类型：1、酶活的调节----活化或钝化（这是快速调节，在几秒到几十分钟内完成。

）2、酶表达水平的调节----诱导或阻遏（通过控制酶数量的调节要牵涉到基因、mRNA、蛋白质的生物合成，所以这种调节是一种慢调节，在几分钟甚至几天内才能完成）
酶活性调节：
1、共价修饰：有物质成分的改变。

（亦称化学修饰，就是在调节酶分子上一个或多个氨基酸残基与一个化学基团共价连接或解开，使其活性改变的作用。

共价结合部位一般为丝氨酸残基。

自从1955年Krebs和Sutherland
等有关糖原磷酸化酶的研究以来，到目前已经知道的有100多种酶在它被翻译后进行共价修饰。

特点及生理意义：需另外酶的参与；共价修饰；具有级联放大效应；耗能少，作用快。

）
2、变构控制：没有物质成分的改变，有形状的改变—构象的改变。

（是指一种小分子物质与一种蛋白质分子发生可逆的相互作用，导致这种蛋白质的构象发生改变，从而改变这种蛋白质与第三种分子的相互作用。

具有变构作用的酶称为变构酶。

）
3、酶原激活。

酶表达水平调节：1、酶的诱导作用。

2、分解代谢物阻遏。

微生物代谢调节（反馈调节）：氨基酸，嘌呤和嘧啶核苷酸生物合成的控制总是以反馈调节方式进行。

其生理意义在于避免物流的浪费与不需要的酶的合成。

两种主要类型的反馈调节:反馈抑制和反馈阻遏。

反馈抑制作用是末端代谢产物抑制其合成途径中参与前几步反应的酶(通常是催化第一步反应的酶)活性的作用。

反馈阻遏作用是末端代谢产物阻止整个代谢途径酶的合成作用。

5、C13的两种重要分析手段（13CMFA原理与方法的一段话背诵填空）
答： 13C MFA原理与方法：在13C标记实验中，以13C作特殊标记的底物（通常为葡萄糖）引入生物反应体系。

随着生化反应的发生，经化学重排、化学键的断裂及新化学键的生成，标记碳原子遍布整个代谢网络、胞内代谢物及生物量组成之中，直至标记碳原子在代谢物库中的同位素丰度达到稳定后取样进行NMR或MS分析。

利用同位素标记底物及NMR或GC-MS(气相色谱-质谱仪)分析胞内代谢物的标记模式，可对单一碳原子建立碳平衡方程，从而将辅助因子的平衡方程排除在外。

此外，由于有许多单一碳原子平衡方程可供利用，常得到一个超定系统。

这种方程冗余能更加准确地估算未知通量。

1)（拟）稳态假设是MFA的重要前提。

代谢稳态和同位素平衡状态。

2) 标记底物的选择必须慎重考虑。

要合理设计标记底物组合方式以获得最大通量信息。

3) 为降低实验中底物用量方面的花费，生物反应器容积应尽量小。

但反应器容积太小系统的稳定条件便很难达到。

因此目前使用的生物反应器容积通常在300-1000mL。

4) 在样品处理方面，对不同代谢物应选择合适的样品处理方法以保证化合物结构不被破坏。

6、同位素进行代谢通量分析
答：代谢通量测定：同位素标记测定。

如果两个原子质子数目相同，但中子数目不同，则他们仍有相同的原子序，在周期表是同一位置的元素，所以两者就叫同位素。

有放射性的同位素称为“放射性同位素”,没有放射性的则称为“稳定同位素”，并不是所有同位素都具有放射性。

放射性同位素（radiosotlope）是不稳定的。

它的原子核会不间断地、自发地放射出射线，直至变成另一种稳定同位素，这就是所谓“核衰变”。

放射性同位素在进行核衰变的时候，可放射出α射线、β射线、γ射线和电子俘获等。

核衰变的速度不受温度、压力、电磁场等外界条件的影响，也不受元素所处化学状态的影响，只和时间有关。

放射性同位素衰变的快慢，通常用“半衰期”来表示。

同位素示踪法的基本原理：可以用同位素作为一种标记，制成含有同位素的标记化合物（如氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核酸类、类脂类、类固醇类及医学研究用的神经药物、受体、维生素和其他药物等）代替相应的不具有标记的化合物。

利用放射性同位素不断地放出特征射线的核物理性质，就可以用核探测器随时追踪它在体内或体外的位置、数量及其转变等。

稳定性同位素虽然不释放射线，但可以利用它与普通相应同位素的质量之差，通过质谱仪、气相层析仪、核磁共振等质量分析仪器来测定。

放射性同位素示踪法特点：
1、灵敏度高。

放射性同位素示踪法可测到10-17－10-21Kg水平，即可以从1015个非放射性原子中检测出一个放射性原子，而迄今最准确的化学分析法很难测定到10-15Kg水平。

2、方法简便。

放射性测定不受其它非放射性物质的干扰，可以省略许多复杂的物质分离步骤。

3、定位定量准确。

放射性同位素示踪法能准确定量地测定代谢物质的转移和转变,与某些形态学技术相结合（如病理组织切片技术，电子显微镜技术等），可以确定放射性示踪剂在组织器官中的定量分布，并且对组织器官的定位准确度可达细胞水平、亚细胞水平乃至分子水平。

4、强的射线对人体有害。

稳定性同位素示踪法的特点：
1、无放射性，无辐射效应及不良影响。

2、安全、对人无伤害。

3、无污染，不受环境条件限制。

4、无衰变，实验时间不受限制。

5、可进行放射性示踪法难以进行的实验。

7、代谢组学常规的代谢分析方法（GC.LC.CE.-MS.NMR的中文全称，2-DE,CE,HPLC-MS,LC-MC）
答：1、代谢流分析(metabolic flux analysis)：又称代谢通量分析，一种计算流经各种途径的通量的技术，用于描述不同途径的相互作用和围绕支点的物流分布。

2、代谢控制分析(metabolic control analysis)：物流控制被分布在途径的所有步骤中，只是若干步骤的物流比他的更大些，可用数学方程来描述反应网络内的控制机制，即用一途径的物流和以物流控制系数来定量表示酶活之间的关系。

8、课本P192，转录组学平台技术、芯片和RNA测序
答：转录组学平台技术：为了高通量并行分析基因的表达情况，各种转录组平台技术得到迅速发展，主要包括：基因芯片技术、基因表达系列分析技术、大规模平行测序技术、RNA测序技术。

9、基因操作的载体必须具备的条件（质粒、载体条件等）
答：质粒载体必须具备的基本条件:
1、具有复制起点(ORI)：这是自我增值必不可少的元件。

2、具有抗菌素抗性基因：这是筛选的标志。

3、具有若干限制性内切酶的单一识别位点：用来插入外源DNA片断，且插入后不影响复制功能。

4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。

三、简答题
1、多元自动化基因工程技术（MAGE）P297
答：2009年Church研究组开发了一种大尺度修改和进化细胞基因组的多元自动化基因组工程技术（MAGE技术）。

该技术将大量人工合成的具有各种突变（包括碱基错配、插入和缺失）的单链DNA库导入宿主细胞进行重组，可以快速高效地得到各种突变株。

该技术快速高效，使得在全基因尺度上对菌株的基因组序列进行设计和修饰成为可能，可极大地加快细胞优化的进程。

MAGE技术的设计思路原理：利用ssDNA同源重组所具有的高效率，对大肠杆菌的基因组进行多元循环修饰。

它的设计思路：同时导入大量的ssDNA组成的文库，文库中的ssDNA与基因组上的不同靶点发生重组，引入事先设计好的或者简并的突变，从而形成一个多样性巨大的基因组库。

这个过程可以循环进行，使细胞获得的突变点不断增加，同时使基因组的多样性不断增大。

原理：将大量ssDNA循环地转入细胞，不同的DNA与基因组不同的位点发生重组，在不同位点发生突变，或者在相同的位点引入不同的突变，从而形成多样性巨大的基因组库，通过引入简并引物，可以对某个位点的序列进行精细的调节。

MAGE技术的七个步骤：1、将细胞培养到对数中期（OD值0.4~0.7）。

2、/4℃热激15min，诱导Beta蛋白的表达。

3、将细胞降温至4℃。

4、在4℃用去离子水洗3次细胞，制作电转化的感受态。

5、将ssDNA的文库和感受态细胞混合。

6、电转化将ssDNA转入细胞，从而发生多元重组。

7、复苏细胞并入下一个循环。

通过一个自动化装置，每一个MAGE循环可以在2.5小时内完成。

2、进化工程的概念
答：进化工程是通过模拟自然进化中的变异和选择过程，在人工选择的压力下实现微生物的进化，最后从进化菌群中筛选出优良性状目的菌株的技术。

3、进化工程的三个主要环节（变异、选择、筛选）
4、酶活性的调节
答：酶活的调节----活化或钝化（这是快速调节，在几秒到几十分钟内完成）。

酶表达水平的调节----诱导或阻遏（通过控制酶数量的调节要牵涉到基因、mRNA、蛋白质的生物合成，所以这种调节是一种慢调节，在几分钟甚至几天内才能完成）。

具体见填空题图。

5、核糖核酸开关的概念及其主要机制P40
图、核糖核酸开关
答：核糖核酸开关是一类mRNA顺式作用元件，它能够直接结合小分子代谢物来改变mRNA分子的构象，从而起到调控基因表达作用，目前发现的核糖核酸开关一般位于mRNA的5’-UTR或3’-UTR。

核糖核酸开关的主要机制：核糖核酸开关位于mRNA的非编码区，通过与代谢物小分子直接结合进行基因表达的调控。

大多数核糖核酸开关都可以分成两个结构域：一个是作为感应器的适体结构域（AD），另外一个是作为基因表达调节结构域的表达平台（EPD）。

AD是一个高度折叠的结构，能感应特定代谢物的浓度，从而选择性地与特定代谢物结合，这种结合会导致其自身以及表达平台的构象发生变化。

表达平台构象的变化可以形成终止子或抗终止子结构，或形成掩蔽或暴露RBS位点、mRNA剪切位点的结构，从而可以在基因转录、翻译或mRNA剪切和加工等水平上调节基因的表达。

在一些真核生物中，核糖核酸开关也存在于3’-UTR区域，可能形成具有自剪切能力的核酶结构，通过和特定代谢物结合后影响核酶活性来控制mRNA的稳定性，从而调控基因的表达。

四、计算题
1、代谢通量平衡方程（丙酮酸）
答：PPT代谢工程-6.7。

2、通过平衡方程计算代谢通量并判断刚性节点和柔性节点
答：PPT代谢工程-6.7.8。

五、论述题
1、以大肠杆菌（酿酒酵母）为宿主构建产乙醇的代谢途径的优缺点
答：大肠杆菌优点：
（1）底物谱宽，可以在廉价培养基上生长，含有木糖代谢基因，可以利用木糖；
（2）适合高密度培养，生长速率快；
（3）大肠杆菌的生理和遗传背景清楚，有利于复杂遗传操作。

（4）在好氧和无氧条件下均能产生乙醇。

缺点：
（1）代谢副产物复杂，比如产生乙酸等副产物
（2）对产物乙醇的耐受能力低，不利于积累高浓度乙醇。

酵母优点：
（1）厌氧生产乙醇时，代谢副产物少，对乙醇的耐受能力高，有利于积累高浓度乙醇。

（2）适合高密度培养。

缺点：
底物谱不够宽，常用的酿酒酵母以粮食为原料，高产乙醇但是不能利用木糖，也就不能利用自然界中大量存在的木质纤维素。

即使能发酵木糖也会产生副产物。

遗传改造有一定困难：把其它菌的木糖异构酶基因导入到酿酒酵母，比如E.coli和B.subtilis 的木糖异构酶基因，但都没有成功，有一定难度。

2、按自己的理解写出代谢工程和合成生物学的区别和联系
答：代谢工程：
代谢工程的定义：利用重组DNA技术对特定的生化反应进行修饰，或引入新的反应以定向改进产物的生成或细胞的性质。

义的特征是：定位需要修饰的目标或打算引入具有专一性的特定生化反应。

代谢工程的要素：将分析方法运用于物流的定量化，用分子生物技术来控制物流以实现所需的遗传改造。

代谢工程两方面：代谢分析和基因操作。

代谢工程以天然微生物为基础，而合成生物学以人造的单元组装微生物为基础。

合成生物学：
Synthetic biology：合成生物学，DNA人工合成技术的应用，合成非天然的代谢调控元件和代谢途径。

定义：合成生物学是：A) 设计和构建新的生物组件、功能单元和系统B) 重新设计已经存在的、天然的生物系统以达到应用目标。

合成生物学旨在设计和构建工程化的生物系统，使其能够处理信息、操作化合物、制造材料、生产能源、提供食物、保持和增强人类的健康和改善我们的环境。

简单地说，合成生物学是通过设计和构建自然界中不存在的人工生物系统来解决能源、材料、健康和环保等问题。

合成生物学的研究内容：生物大分子的合成与模块化，生物基因组的合成、简化与重构，合成代谢网络，遗传/基因线路的设计与构建，细胞群体系统及多细胞系统研究，数学模拟和功能预测。

合成生物学的意义：加速合成生物系统工程化的进程，验证和深化对于生物现象的理解。