结核分枝杆菌常见耐药基因突变的检测及分析

广州医学院
硕士研究生学位论文
结核分枝杆菌常见耐药基因突变的检测与
分析
Detection and evaluation of common drug-resistance gene mutations in Mycobacterium tuberculosis
专业名称: 临床检验诊断学
研究生: 杨辉
导师: 吴爱武教授
陈心春教授
二0一三年三月·广州
目录
中文摘要~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~1 英文摘要~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~4 英文缩略词~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 7 前言~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~8 第一部分利福平耐药结核分枝杆菌rpoB 基因的检测与分析~~~~~~~~~~~~ 11
1.材料和方法~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 11
2.结果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~16
3.讨论~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~18
4.小结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~20 第二部分异烟肼耐药结核分枝杆菌相关耐药基因的检测与分析~~~~~~~~~~~21
1.材料和方法~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 21
2.结果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~27
3.讨论~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~30
4.小结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~31 第三部分HRMA技术检测结核分枝杆菌利福平与异烟肼耐药~~~~~~~~~~~~ 32
1.材料和方法~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 32
2.结果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~36
3.讨论~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~42
4.小结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~44 全文总结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 45 参考文献~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 46 综述~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~51 附录~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~59 攻读学位期间取得研究成果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 61 致谢~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~63 学位原创性声明~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~64 学术论文知识产权声明~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~64 关于学术论文使用授权的说明~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~64
结核分枝杆菌常见耐药基因突变的检测与
分析
研究生：杨辉
导师：吴爱武教授
陈心春教授
中文摘要
研究背景及目的
结核分枝杆菌（结核菌，Mycobacterium tuberculosis，MTB)是引起结核病的病原菌，至今仍然是单一感染因素导致死亡率最多的疾病之一。

利福平和异烟肼作为抗结核病治疗的一线药物在临床应用已50余年，耐药率逐年增多，已成为不容忽视的严重问题。

目前的研究发现结核菌发生耐药的原因是抗结核药物作用相关基因发生突变导致抗结核药物与药物作用结合位点亲和力下降所致。

结核菌培养药敏实验是目前诊断结核菌耐药的金标准，但其培养时间过长、易污染等，不能给临床医师提供相应快速的药敏结果，限制了其临床应用。

本研究拟通过对临床标本中分离的利福平（rifampicin，RIF）和异烟肼（isoniazid, INH)耐药的结核菌的耐药特征进行分析，应用分子生物学方法主要包括聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）和高分辨率融解曲线分析（high resolution melting analysis, HRMA) 技术检测其引起耐药的常见基因突变情况，分析引起结核菌耐药的常见基因的突变特征及可能的耐药机制，了解HRMA技术检测结果与结核菌培养药敏结果的差异，探讨HRMA在临床推广使用的可能性。

1. 收集已知药敏结果的临床结核菌分离株60株，其中15株对利福平敏感，45株对利福平耐药，提取DNA采用PCR方法检测其rpoB基因及其其中的利福平耐药决定区（rifampin resistant determination region, RRDR)的利福平耐药相关基因,并通过T-A克隆构建质粒后进行测序，检查其突变情况。

2. 收集已知药敏结果的临床结核菌分离株60株，其中19株对异烟肼敏感，41株对异烟肼耐药，提取DNA采用PCR方法检测其异烟肼耐药相关基因kasA 基因、katG基因和inhA基因的启动子区域,并通过T-A克隆构建质粒后进行测序，检查这些基因突变情况。

3. 应用HRMA技术检测237株临床结核菌分离株rpoB、katG基因和inhA 基因启动子的突变情况，进而分析判断其耐药机制，并与结核菌临床药敏培养结果进行比较。

实验结果
1.在60株结核菌临床分离株rpoB基因检测中，15株利福平敏感结核菌均未检出突变；45株利福平耐药结核菌中有41株存在突变，突变率为91.1%（41/45）。

最易发生突变的位点为531位点，突变率为51.2%（21/41),其次为526、516位点，这3个位点总突变率共占rpoB基因RRDR突变的8
2.9%（34/41)。

2.在60株结核菌临床分离株katG基因、kasA基因和inhA基因启动子检测中，19株异烟肼敏感株均未检出突变。

41株异烟肼耐药菌株中，katG315位点突变的发生率为70.7%（29/41），inhA基因启动子-15位点发生C-T突变，发生这种突变的菌株占异烟肼耐药株的21.95%（9/41），kasA基因突变率较低。

3. 应用HRMA检测rpoB基因和katG基因、inhA基因的启动子突变情况并与结核菌临床药敏培养结果（金标准）进行比较。

发现对于培养结果为利福平耐药的菌株，HRMA技术检测结果符合率为95.4%，特异性为97.6%，敏感性为88.9%；对于培养结果为异烟肼耐药的菌株，HRMA技术检测结果符合率为9
4.9%，特异性为9
5.9%，敏感性为92.5%。

1. rpoB基因突变是结核菌对利福平耐药的原因之一，其主要突变位点为531、526、516。

2. katG基因和inhA基因启动子突变是结核菌对异烟肼耐药的原因之一，主要突变形式为katG315（AGC-ACC）和inhA-15（C-T）。

3.高分辨率融解曲线分析技术与结核菌培养药敏结果具有较好的一致性，具有在临床推广使用的可能。

关键词
结核分枝杆菌；利福平；异烟肼；耐药；高分辨率融解曲线分析
Detection and evaluation of common drug-resistance gene mutations in Mycobacterium tuberculosis
Master Degree Candidate: Hui Yang
Tutor : Prof . Aiwu Wu
Prof. Xinchun Chen
Abstract
Background and Objectives
Tuberculosis(TB) is caused by the infection of Mycobacterium tuberculosis(MTB), and it is still one of diseases with higher mortality caused by single infectious factor.. As first-line treatment drugs, such as rifampicin and isoniazid, have been used nearly 50 years in clinical application, and drug resistance rate is increasing year by year, which become a serious problem that can not be ignored. The present study show that the reason of drug resistance is the occurrence of related gene mutations in MTB, which decreased the affinity between the drug and target gene. Mycobacterium tuberculosis drug susceptibility test is the golden standard for the diagnosis of TB drug resistance, but the shortcoming of the test is long incubation time and microorganism’s pollution, and it couldn’t provide drug resistance results accurately, so it could not be used in clinical laborator widely. This study will focus on the drugs, such as rifampicin and isoniazid(INH), resistance characteristics of Mycobacterium tuberculosis strain that were isolated from clinical specimen . molecular biological methods such as polymerase chain reaction and high resolution melting curve analysis(HRMA) technique will be used to detect and analyze the
common mutation gene in Mycobacterium tuberculosis strains , and HRMA technology will be compared with Mycobacterium tuberculosis drug susceptibility test.
Methods
1. To collect 60 Mycobacterium tuberculosis strains isolated from clinical samples, among which 15 strains were sensitive to rifampin, and 45 strains were resistant to rifampicin. Genome DNA was purified, after PCR amplification, gene rpoB with rifampin resistant determination region(RRDR) will be detected,, and amplicon of gene rpoB will were cloned into T-vector and sequenced to check its gene mutation.
2. To collect of 60 Mycobacterium tuberculosis strains isolated from clinical samples, including 19 strains with sensitivity to isoniazid, 41 strains with resistance to isoniazid. Genome DNA was purified, after PCR amplification, gene kasA, katG and inhA gene promoter regions that are related with isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis, were detected , these gene amplicon were cloned into T-vector and sequenced to check their gene mutations.
3. HRMA technology was used to detect gene mutation of gene rpoB, katG and gene inhA promoter region of 237 Mycobacterium tuberculosis strains,, and the detection results of HRMA will be compared with Mycobacterium tuberculosis drug susceptibility test(golden standard).
Results
1 .Among 60 Mycobacterium tuberculosis strains isolated from clinical samples, rpoB gene mutation was detected. No rpoB gene mutation was detected in 15 strains with the phenotype of rifampin sensitivity; among 45 strains with the phenotype of
rifampin resistance, the gene mutation rate was 91.1% (41/45). The most frequent mutation sites located on 531, the mutation rate was 51.2% (21/41), followed by sites 526, 516, the total mutation rate of 3 sites in gene mutation of rpoB gene with RRDR were 82.9% (34/41).
2 Among 60 Mycobacterium tuberculosis strains , no gene mutation was detected in 19 strains with the phenotype of isoniazid sensitivity. Among 41strains with the phenotype of isoniazid resistance, the incidence of katG315 gene mutation was 70.7% (29/41),inhA gene promoter region -15 sites appeared C-T mutations, the C-T mutation rate were 21.95% (9/41), the frequency of kasA gene mutation was low.
3 To rifampin resistance Mycobacterium tuberculosis strains, the coincident rate between the golden standard results and HRMA results was 95.4%, the specificity was 97.6%, the sensitivity was 88.9%; to INH resistance strains, the coincident rate between the golden standard results and HRMA results was 94.9%, the specificity was 95.9%, the sensitivity was 92.5%.
Conclusions
1 .Gene mutation of rpoB gene is one of the reasons of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis strains, the main mutation sites located on 531, 526, 516.
2. Gene mutation of gene katG and gene inhA promoter region is one of the causes of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis strains, the mutation form were mainly katG315 (AGC-ACC) and inhA-15 (C-T).
3. The detection results of drug resistance between high resolution melting curve analysis(HRMA) technology and golden standard in Mycobacterium tuberculosis strains was coincident, HRMA could be used in clinical laboratory for detecting drugs resistance of Mycobacterium tuberculosis strains .
Key words
Mycobacterium tuberculosis; Rifampicin; Isoniazid; Drugs resistance; High resolution melting analysis
英文缩略词
中文名称英文名称缩略词结核分枝杆菌mycobacterium tuberculosis MTB 利福平 rifampicin RIF 异烟肼 isoniazid INH 高分辨率融解曲线分析 high resolution melting analysis HRMA 耐多药结核病 multidrug resistance tuberculosis MDR-TB 单核苷酸多态性 single nucleotide polymorphism SNP
耐利福平决定区 rifampicin resistance determination region RRDR 聚合酶链反应polymerase chain reaction PCR
前言
结核病是由结核分枝杆菌（结核菌）感染所导致的疾病。

自20世纪后期开始，结核病发病率逐渐上升，至今仍然是单一感染因素引起死亡人数最多的疾病之一[1]。

根据世界卫生组织（World Health Organization,WHO)2012年的最新统计报告，全球将近三分之一的人口曾经或者现在感染结核分枝杆菌，2011年全球新增结核病人870万人，将近140万人因为结核病而丧失生命[2]。

2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查结果显示，我国仍然是结核病高负担国家，虽然结核病发病率较上次调查呈现下降趋势，但又出现了新的问题，结核病耐药率显著增高，尤其是耐多药结核病（multidrug resistance tuberculosis,MDR-TB)的出现使得结核病治愈率明显降低[3]。

根据产生原因的不同可将耐药结核病分为两种：原发性耐药和获得性耐药。

原发性耐药是指没有接受过抗结核药物治疗而发生的结核菌耐药；获得性耐药是指存在既往抗结核病药物治疗史（超过1个月），由于用药不规范或者其他原因诱导的耐药[4]。

结核菌耐药突变株的自然变异率很低，且多为耐单药菌株，其中耐利福平突变概率为10-8 ，耐异烟肼突变概率为10-6 ，同时对异烟肼和利福平耐药的野生突变株出现的概率仅为10-14，因此病灶内同时出现耐两种或以上（特别是耐异烟肼和利福平）药物的野生突变株的概率几乎可以忽略不计，而且各个耐药基因突变位点不相连，不会因某位点突变而同时引起对2种以上药物耐药，因此，原发性耐药一般多由耐药菌株的直接传播引起[5]。

过去普遍认为，结核病耐药是由于化疗方案不合理、服药不规律、患者不配合、药物质量欠佳等人为原因导致而产生的，实际上这只考虑到获得性耐药，忽略了原发性耐药。

根据2000年全国结核病流行病学调查结果，原发耐药率和获得性耐药率分别为18.6%和46.5%[6]，8省（自治区）结核病耐药监测项目结果，原发耐药率为14.8%（浙江）～35.7%（内蒙古），获得性耐药率为33.7%（广东）～66%（河南）[7-10]。

由于目前结核病耐药监测只计算结核的原发（初始）耐药率和获得性（复治）耐药率，而前者总是低于后者，实际上，在该项结果中，所有耐药菌株中平均77.5%（47.1%～90.5%）为初始耐药，随着耐药菌株的传播以及结核治疗过程中人为干扰因素的减少，原发性耐药会逐渐增多，在许多结核病控制较好的地区原发耐药结核患者
已占全部耐药患者的多数[11]。

因此如果不将原发性耐药在总耐药病例中所占的比例正确的反应出来，很容易忽略原发性耐药在耐药结核中的重要作用。

随着科学技术的逐渐发展，结核病的的耐药机制及分子基础正被慢慢解开，目前的研究发现结核菌发生耐药的原因是抗结核药物作用相关基因发生突变导致抗结核药物与药物作用结合位点亲和力下降所致。

越来越多的研究者试图利用各种快捷方法进行结核病耐药检测。

目前耐药结核病的诊断方法种类繁多，主要可以分为表型检测和基因检测两个方面。

表型检测方法主要有结核分枝杆菌药敏试验[12]、快速检查耐药突变显微镜观察法[13]、噬菌体药敏法[14]、流式细胞术药敏试验[15]，但这些种方法均存在较大局限性，远不能满足临床需求。

因此结核菌的耐药研究方向逐渐转向基因检测，耐药结核病基因检测主要方法有聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）[16，17]、限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）[18]、双脱氧指纹图法（ddF）[19]、反向系列探针杂交法（AiPA）[20,21]、直接测序法[22]以及基因芯片法[23]等,但这些方法也各有各的缺陷，未能大范围普及。

高分辨率熔解曲线（high resolution melting analysis ,HRMA）分析技术是2002年美国犹他大学Carl Wittwer实验室与爱德华科技公司合作开发的一种新技术，这种方法最初应用于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP）检测分析[24]。

它的实质是在常规PCR的基础上加入饱和染料，无需使用特异性探针，在PCR反应扩增完成后进行熔解分析，进而得到检测结果[25]。

HRMA技术是建立在核酸分子的物理性质不同的基础上，每个核酸分子的GC 含量、GC分布、核酸长度都是不同的，通过实时监测升温过程中的饱和染料与PCR 产物的结合情况，仪器通过收集这些信息进入分析软件，形成各自的熔解曲线[26]。

在利用HRMA扩增含有碱基突变位点的耐药相关基因的过程中，由于突变位点的碱基不匹配，结合力相对较弱，双链DNA分子在升温过程中会比野生型先解开，荧光染料从局部解链的DNA分子释放，其熔解温度反映在熔解曲线上就会相应降低，根据荧光强度和温度的曲线就可以判断是否存在碱基突变。

而且不同的基因位点、不同突变形式都会影响熔解曲线的峰形，因此，HRMA能有效地检测结核菌耐药的发生情况[25]。

耐多药结核病是指至少对利福平（rifampin，RFP）、异烟肼（isoniazid，INH）这两种一线抗结核治疗药物同时耐药的结核病[27]。

根据WHO2012年统计报
告显示，仅仅在2011年全球27个耐多药结核高负担国家新增耐多药结核病患者超过60000人，占新发结核病人的19%[2]。

随着结核病疫情的日益严重，尤其是耐药结核病的大量产生，早期检测结核病耐药，并给以适当药物治疗已迫在眉睫。

2009年在北京举行的“全球结核病控制和患者治疗耐多药/广耐药结核病高负担国家部长级”会议一致认为耐多药/广耐药结核病的流行已对全球公共卫生安全构成威胁，需要加快行动扩展原发性耐药尤其是耐多药/广耐药结核病的诊断和治疗服务[3]。

本研究拟通过利用分子生物学方法来探讨结核菌对利福平、异烟肼耐药的分子机制，分析其耐药相关基因突变形式与特点；同时使用HRMA技术来检测结核菌利福平、异烟肼的相关耐药基因，根据其检测位点的突变情况来判断其耐药性，从而实现快速检测结核菌耐药的目的。

第一部分利福平耐药结核分枝杆菌rpoB
基因的检测与分析
利福平（rifampin，RFP）是利福霉素类半合成的广谱抗菌药，自20世纪70年代出现就成为结核分枝杆菌的首选抗菌药物之一[28]。

该药对结核分枝杆菌和某些非结核分枝杆菌在宿主细胞内外均有明显的杀菌作用，其作用机理为能够与依赖DNA的RNA聚合酶的β亚单位结合，抑制细菌RNA的合成，发挥其抗菌作用[29]。

rpoB基因是结核菌DNA依赖RNA聚合酶β亚单位的编码基因，当其核心区域利福平耐受决定区（rifampicin resistance determination region,RRDR）发生突变时，包括点突变、缺失、插入等，均能使DNA依赖的RNA聚合酶B亚单位酶结构改变，使其不能很好的与利福平药物结合而表现为结核菌耐药[30]。

根据现有文献报道，95%以上的利福平耐药与RRDR发生突变有关，尤其是该区域的531、526、516位点[31-33]。

因此可基本认为检测利福平基因突变的实质就是检测rpoB基因的RRDR区域是否存在突变。

为了进一步获得深圳地区结核菌耐药基因突变的第一手资料，并为后续实验构建阳性质粒，特进行了下述实验：
1.材料和方法
1.1 菌株来源：结核分枝杆菌H37Rv标准株DNA由香港大学微生物实验室馈赠。

15株结核分枝杆菌利福平敏感株和45株结核分枝杆菌利福平耐药株来源于深圳市第三人民医院微生物实验室。

1.2 仪器与试剂：
结核菌DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒购自美国Axygen公司质粒提取试剂盒购自美国Axygen公司TaKaRa Ex T aq® (DRR100B) 购自TAK ARA公司p M D®18-T V e c t o r（D101A）购自T A K A R A公司Veriti 96 well thernal cycler PCR仪购自美国ABI 公司
DYY-7C电泳仪购自北京市六一仪器厂高速离心机购自Beckman公司恒温箱购自上海市精密仪器设备公司凝胶图像分析仪及软件购自美国BIO-RAD公司Nanodrop 2000C分光光度计购自美国THermo Scientific公司TAE50X 电泳缓冲液购自上海市生工生物工程公司PCR反应管、1.5ml离心管、Tip头购自美国Axygen公司电子分析天平购自satorius公司胰蛋白胨、酵母提取物购自OXOID公司产品氯化钠购自广东光华化学有限公司氨苄青霉素、琼脂粉购自上海源叶生物科技有限公司琼脂糖粉购自Bio Basic Inc公司1.3 试剂配制
1.3.1 TAE电泳液的制备：取20ml的TAE50X电泳缓冲液稀释到1000ml备用1.3.2 氨苄青霉素的配制：将氨苄青霉素用去离子水融解至100mg/L,并使用过滤塞进行过滤，去除杂质，-20℃保存备用。

1.3.3 LB液体培养基的制备：使用电子分析天平，称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，混合置于1000ml三角烧瓶中，并加入去离子水900ml融解，然后使用NaOH进行PH校正（PH=7.2），最后再加入去离子水定容至1000ml，混匀分装后进行高压灭菌，保存备用。

1.3.4 LB固体培养基的制备：使用电子分析天平，称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，混合置于三角烧瓶中，加入去离子水900ml 融解，然后使用NaOH进行PH校正（PH=7.2），最后再加入去离子水定容至1000ml，混匀分装后进行高压灭菌，将灭菌后的LB培养基100ml加入事先制备的氨苄青霉素100μl，使其终浓度为100μg/ml，分别倒入一次性塑料培养板中，制备LB 固体培养平板备用。

1.4 结核菌DNA的提取（参考Qiagen公司DNA提取试剂盒说明书）
1.4.1 试剂盒中试剂均按其说明书进行配制。

1.4.2 取1--4ml含有已知药敏结果结核菌的7H9 MiddleBrook 液体培养物，
13000rpm离心沉淀15min，弃上清，使用PBS缓冲液润洗2次，13000rpm 离心1min ，弃上清，用400μL PBS缓冲液进行悬浮，振匀。

1.4.3 将该悬浮液置于80℃水浴30min，进行灭活。

1.4.4 待冷却后，加入40μL 蛋白酶k裂解液进行混匀裂解。

1.4.5 再加入AL buffer 400μL 进行震荡混匀。

1.4.6 将上述混合液置于56℃水浴箱水浴，水浴时间15min。

1.4.7 往混合液中再加入400μL 无水乙醇进行混匀。

1.4.8 吸取650μL混合液于核酸纯化柱，13000rpm 1min离心，弃废液。

1.4.9 吸取剩余混合液再次加入核酸纯化柱，13000rpm 1min 离心，弃废液。

1.4.10 吸取洗液Buffer AW1 500μL 加入到核酸纯化柱中进行洗涤，13000rpm 1min离心，弃废液。

1.4.11 吸取洗液Buffer AW2 600μL 加入到核酸纯化柱中进行洗涤，13000rpm 1min离心，弃废液。

1.4.12 重复上一步骤。

1.4.13 将核酸纯化柱进行空离，13000rpm 2min离心，换取收集管。

1.4.14 吸取30μL 去离子水加入到纯化柱静置5min后进行洗脱，保存备用。

1.5 细菌DNA提取浓度的检测: 吸取2μL提取的DNA加入到分光光度计中，进行检测，根据DNA浓度统一稀释到5ng/μL，并保存备用。

1.6 针对目的基因rpoB基因RRDR区域进行引物设计，引物由深圳凯杰生物公司设计，上海生工生物公司进行合成。

上游引物p r i m e r1为5’-C C G A C G A C A T C G A C C A C T T-3’，下游引物p r i m e r2为5’- CACGATCTCGTCGCTAACCA-3’，全长488bp，引物浓度稀释到10ng/μL备用。

1.7 应用普通PCR对rpoB基因进行检测
(1) PCR反应体系：
10×PCR buffer 5μL
Ex-Taq-HS 1μL
dNTP 4μL
Primer1 1μL
Primer2 1μL
DNA 2μL
O 36μL
ddH
2
Total 50μL
(2) PCR反应条件：
预变性 95℃ 10min
变性 95℃ 30s
退火 58℃ 20s 30个循环
延伸 72℃ 20s
延伸维持 72℃ 10min
1.8 PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳鉴定：取PCR反应产物5μL，加6×Loading buffer 1μL混匀，于1%琼脂糖凝胶（绿如蓝染料）中进行电泳，电泳时所使用的电压为120V，持续时间30min，紫外成像系统中观察。

1.9 将鉴定好的PCR产物进行PCR纯化，使用Axygen公司的PCR纯化试剂盒，操作按照其说明书进行，试剂盒中试剂按照其说明书进行配置：
1.9.1 在PCR产物反应管中加入3倍体积的Buffer-PCR-A，即135μL，混匀。

1.9.2 将上述混合液加入到PCR纯化柱中，13000rpm 1min离心，弃废液。

1.9.3 往PCR纯化柱中加入700μL的Buffer W2 洗液，13000rpm 1min离心，弃废液。

1.9.4 往PCR纯化柱中加入500μL的Buffer W2 洗液，13000rpm 1min 离心，弃废液。

1.9.5 更换收集管进行空离，13000rpm 2min离心，弃离心管，接收集管。

1.9.6 吸取30μL去离子水加入到纯化柱中，静置5min后离心 13000rpm 1min 保存备用。

1.9.7 回收产物浓度的检测: 吸取2μL提取的DNA加入到分光光度计中，进行检测，根据其DNA浓度统一稀释到10ng/μL，并保存备用。

2.0 使用TAKARA公司的pMD®18-T Vector 试剂盒进行T-A克隆，构建阳性突变质粒，操作按照其说明书进行。

2.0.1 T-A克隆连接体系
核酸DNA 4μL
T载体 1μL 10μL
Solution I缓冲液 5μL
2.0.2 将上述液体混匀后置于16℃恒温箱连接过夜。

2.0.3 将事先准备好的DH5α细胞放在冰上融解，后吸取10μL混合液转入DH5α细胞，混匀冰浴30min。

2.0.4 进行热冲击，42℃水浴， 1min后放入冰盒冷却。

2.0.5 往冷却后的DH5α细胞中加入890μL LB培养基，置于37℃摇床温箱中孵育150rpm 1小时。

2.0.6 吸取200μL孵育好的细菌菌液均匀涂在含有氨苄青霉素的LB固定培养版中，置于37℃温箱中培养18-24h。

2.1 阳性质粒的鉴定：挑选平板上的单个菌落，进行扩菌生长6-8小时，待菌液浑浊后进行菌落PCR鉴定，PCR反应条件和PCR反应体系如下：
（1） PCR反应体系：
10×PCR buffer 5μL
Ex-Taq-HS 1μL
dNTP 4μL
Primer1 1μL
Primer2 1μL
DNA 3μL
ddH
O 35μL
2
Total 50μL
（2） PCR反应条件：
预变性 95℃ 15min
变性 95℃ 30s
退火 55℃ 30s 40个循环
延伸 72℃ 30s
延伸维持 72℃ 10min
2.2 将菌落PCR鉴定为rpoB基因阳性的单克隆细菌送到华大基因公司测序，并将测序结果与结核菌H37Rv标准株序列进行比对，寻找其突变位点，同时将菌液保存备用。

2.实验结果
2.1 rpoB基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图见图1：M为marker，1号泳道为阴性对照，2-7号泳道为结核菌临床株DNA的PCR扩增样本。

图1：结核菌临床株rpoB基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图
2.2 T-A克隆后的单个菌落进行rpoB基因PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳图见图2：左右2边条带均为marker，中间各泳道为单克隆鉴定结果，某些空白泳道为假阳性菌落，随机选择阳性克隆送出测序。

图2：T-A克隆后菌落DNA rpoB基因PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图
2.3 测序结果分析：目的基因被扩增片段全长488bp，针对其中81bp的利福平耐药决定区（RRDR）检查其突变情况，发现在这60个菌株中，15株利福平敏感结核菌均未检出突变；45株利福平耐药结核菌中有41株存在突变，突变率为91.1%
（41/45）。

在这41株RRDR区域存在突变的结核菌中，32株结核菌发生单一突变，8株结核菌出现多重突变，1株出现rpoB基因510和511位点的缺失。

其中，最易发生突变的位点为531位点，突变率为51.2%（21/41),其次为526、516位点，这3个位点总突变率共占rpoB基因RRDR突变的82.9%（34/41)。

各位点突变结果如下表（表1）。

3 讨论
利福平是治疗结核分枝杆菌感染的首选药物之一，特别是在短期治疗中起到重要的作用。

自1965年发明以来，作为一个新出现的广谱抗菌药，广泛应用于
各种细菌的感染。

而且在这近四十多年的应用中，发现其副作用不多，主要副作用为转氨酶增高，而且大部分为一过性升高，停药后可以恢复。

其抗结核作用机制主要是，利福平通过与结核菌菌体RNA聚合酶结合后，干扰结核菌DNA及蛋白质的合成，从而起到杀灭结核菌的目的，更为重要的是若出现结核菌对其耐药，此时利福平虽不能杀灭细菌，但可以起到限制细菌生长的作用[34]。

目前，结核病的控制情况不容乐观，耐药结核菌的产生给患者治疗带来了更大的困难，主要包括医疗费用的增加、治疗难度的增大，治愈率下降、死亡率增高等。

因此，利福平作为临床结核病治疗首选药物之一，早期诊断其是否耐药已成为迫切需求。

目前应用在临床检测中的结核菌药敏试验金标准仍然是结核菌培养药敏试验，但此方法时间太长，早已不能满足临床需求，因此早日检测利福平耐药并采取措施是大多数临床医务工作者和结核病患者的共同梦想。

所以，基因检测结核菌耐药成为目前发展的主流方向，但在进行相关检测之前，确定本地结核菌耐药基因突变情况的模式与特点，构建阳性突变质粒作为日后应用的阳性参照物是必要的。

rpoB基因是细菌RNA聚合酶的β亚基的编码基因，当其中的利福平耐药决定区发生突变时，DNA依赖的RNA聚合酶B亚单位结构发生改变，从而发生耐药[29]。

本次研究对60株结核菌临床分离株rpoB基因的检测结果表明，15株敏感株在rpoB基因中均未发生突变，45株耐药株中有41株rpoB基因发生了突变，共有12种突变形式，其中最主要的突变形式是Ser531Leu（51.2%），其次为526、516、533等密码子突变。

在出现突变的菌株中，32株为单个碱基发生突变，8株为多碱基突变，1株出现rpoB 510和rpoB 511位点缺失，主要以单点突变为主。

通过本次研究可以发现在深圳地区结核菌rpoB基因发生突变是其发生利福平耐药的原因之一，突变主要发生在RRDR，这一区域中不同位点突变的频率不同，其中主要以531、526和516位点突变为主。

本次测序结果与曾有文献报道的广东地区rpoB基因突变的结果相似[30]，突变位点均以531、526、516、533为主，各位点的突变频率也极为相似，这4个位点突变率占整个rpoB基因突变率的90%以上,说明广东地区利福平耐药突变位点相对稳定，快速检测这些位点是否存在突变可作为判断结核分枝杆菌是否对利福平耐药的依据。

但本次测序结果有1株结核分枝杆菌出现了rpoB 510和rpoB 511的缺失，说明rpoB基因RRDR 可能不是结核分枝杆菌生存所必须。

与国外报道相比，rpoB 531的突变频率有。