共聚焦显微镜汇报

牛肺动脉内皮细胞
蓝色：Hoechst 33342 染DNA 红色：PI，染核仁RNA 绿色：Alexa Fluor 488 染肌丝蛋白
藤黄微球菌 绿色：活菌 红色：死菌 染色：LIVE/DEAD
BacLight
Bacterial Viability Kit
猴胚肾细胞内弓形虫繁殖 吖叮橙染色 绿色为DNA 红色为RNA
按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，
可控制样品扫描层面的厚度。即样品中相当 薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。
分层扫描（切片扫描）
当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样 品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来 观测。
发射光
入射光 被检测层面
整个样品 白光（不能透过）
分层扫描（切片扫描）
• 利用共聚焦光路和激光扫描获得生 物样品的显微断层图象，动态扫描 记录、图像处理及三维立体构建、 成份分析等软件。
激光共聚焦显微镜构成
显微镜 步近器
激光器 光电倍增管 检测器
计算机 电子图像 软件
共聚焦显微镜的特点
光源 共聚焦技术 点扫描技术 信号放大 电子图像 软件
1、光源 用激光做光源，从理论上消除
激光共聚焦显微镜的优势
在结构方面
激光做光源，光色纯，波长固定，成像 效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检 测信噪比高
可实现分层扫描 可实现连续扫描，可动态记录变化 可多根激光管同时扫描，多色荧光同时
成像 扫描速度快，对样品损伤小
激光共聚焦显微镜的优势
在应用方面
形态观察--高清晰成像 半定量--荧光强度分析 荧光探针表达量测定 定位研究--分层扫描 多种荧光标记同时检测 荧光标记物绝对定量分析 扩展应用---如，FRAP法、细胞切割、
利用专用图象处理软件，还可以实现其他许 多数据分析。
植物切片三维重建
多色荧光标记检测
普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光， 要观测多种荧光标记的样品需要多次观 测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜 可以多激光多通道同时扫描，多通道同 时探测。
Mouse 3T3 cells 红色：ethidium homodimer–1 ，染核 绿色：BODIPY FL phallacidin，染肌丝蛋白
高清晰成像
• 激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的 光线被抑制，减少了成像的干扰，以及使用光色 较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微 镜的1.4倍。
• 可以清晰的表现某些细微结构。
人眼分辨率：
0.2mm
光学显微镜分辨率：0.25mm
电子显微镜分辨率：0.2nm
共焦显微镜分辨率：0.18mm
较厚层面
较薄层面
人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。
分层扫描（切片扫描）
较厚层面 （平滑肌损伤可见）
较薄层面
兔动脉血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。
分层扫描（切片扫描）
连续分层扫描，可得到CT片类似的效果，对 样品Z轴的结构进行分析。经计算机数据重组， 可观测空间结构，空间定位，三维重组。
树突状细胞
培养细胞
荧光表达量测定
Sunil S et al., Extracellular polymeric substances and structural stability of aerobic granule, Water Research, 42(2008)1644–1650
分层扫描（切片扫描）
光电倍增管放大信号，计 算机采集和处理光信号。
计算机代替了人眼或照相
机进行观察、摄像，得到的图 象是数字化的，可以在电脑中 进行处理，再一次提高图象的 清晰度。
共聚焦显微镜的应用
1) 高清晰成像 2) 半定量荧光强度分析 3) 荧光探针表达量测定 4) 分层扫描 5) 多种荧光标记同时检测 6) 荧光标记物绝对定量分析 7) 扩展应用
• 应用学科：
– 细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）
共聚焦显微镜的原理简介 （ Confocal Laser Scan Microscope CLSM）
从某种意义上讲，共聚焦显微镜 是一种现代化的光学显微镜，它对传
统的光镜从以下几方面作了改进
原理简介
• 在显微镜基础上配置激光光源，扫 描装置，共扼聚焦装置和检测系统 而形成的新型显微镜。
了色差。因为激光的单色性强、 光源波束集中、波长相同。
2、采用了共扼聚焦技术 在物镜的焦平面上放置了一个小孔，
将焦平面以外的杂散光挡住，消除 了球差。
共扼聚焦原理图
样品
激光器 扩光器
入射光 发射光 滤光片
长通滤光片
针孔
检测器
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样品
激光器 扩光器
入射光 发射光 滤光片
长通滤光片
针孔
检测器
样品
激光器 扩光器
基本介绍
• 中文名称：
– 激光扫描共聚焦显微镜
• 英文名称：
– Confocal Laser Scanning Microscopy;CLSM
• 定义：
– 利用激光点作为荧光的激发光并通过扫描装置对标本进 行连续扫描，并通过空间共轭光阑（针孔）阻挡离焦平 面光线而成像的一种显微镜。是当今世界最先进的细胞 生物学分析仪器。
高清晰成像
牛肺动脉内皮细胞 ，微管
高清晰成像
牛肺动脉内皮细胞 ，微管
高清晰成像
鼠成纤维细 胞
单克隆anti– β-tubulin
标记
高清晰成像
检测人类癌细胞表皮生长因子
高清晰成像
培养的293细胞绿色荧光蛋白
高清晰成像
培养的人肝癌细胞哑叮橙染色
透射光扫描（DIC）
利用激光透射扫描成像， 用特殊滤光片达到相差显微 镜的效果，可获得清晰的具 有立体感的图片
入射光 发射光 滤光片
长通滤光片
针孔
检测器
普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别
3、点与面扫描技术
共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三 维空间上的无数点，用十分细小的激光束 （点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计 算机软件组合，最后得到一个整体平面的
或立体的像。
普通光镜：是在可见光源下一次性成像。
4、图像信号及处理：
细胞筛选等
激光共聚焦显微镜的优势
在效果方面 更灵敏： 共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱 的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。 定位更精确： 不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞 水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为 分子探针的原因