条斑紫菜提取物对4种赤潮微藻生长的抑制作用_孙颖颖

关键词：条斑紫菜；赤潮微藻；生长抑制作用
中图分类号：Q 949. 2；X 55
文献标识码：A
海藻不仅能够净化水质，还能与赤潮微藻进 行营养竞争［1］，防止赤潮生物的爆发性增殖。同 时，它们还 能 向 环 境 中 分 泌 抑 藻 物 质，抑 制 赤 潮 微 藻 的 生 长［2 － 4］。 例 如，小 珊 瑚 藻 （ Corallina pilulifera ） 抑 制 多 环 旋 沟 藻 （ Cochlodinium polykrikoides）［5］、孔石莼 （ Ulva pertusa） 抑制赤潮 异弯藻（ Heterosigma akashiwo） 和塔玛亚历山大藻 （ Alexandrum tamarense ）［6］、鼠 尾 藻 （ Surgassum thunbergii） 、缘管条斑紫菜（ Enteromorpha linza） 和 石花菜 （ Gelidium amansii） 抑 制 赤 潮 异 弯 藻［7 － 8］ 等。随着海藻抑制微藻研究的逐渐深入，某些海 藻的 抑 藻 物 质 已 见 诸 于 相 关 报 道。从 墨 角 藻
条斑紫菜水溶性抽提液的抑藻作用 移 取 150 mL 实验用液于 250 mL 锥形瓶内，同时， 设定新鲜海水配制的 f /2 培养基作为对照，每个
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水产学报
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锥形瓶设定 3 个重复。将对数生长期微藻以藻 泥接种于锥形瓶内，前沟藻、中肋骨条藻、塔玛亚 历山大藻和米氏凯伦藻依次为 9 × 104 cells / mL、 13 × 104 cells / mL、9 × 104 cells / mL 和 8 × 104 cells / mL［26］（4 种赤潮微藻起始密度的确定是根 据文献所述 赤 潮 发 生 时 所 能 达 到 的 最 高 密 度 ） 。 锥形瓶放置于 GXZ － 260B 智能光照培养箱内培 养 12 天，温度 20 ℃ ，光照强度 3 000 lx，光暗比 8 ∶ 12。每日定时摇动锥形瓶 3 次，每隔一日采样 1 mL，用 Lugol 氏试剂固定后，计数藻细胞密度；并 且，取样后向每一个锥形瓶中加入 1 mL 150 倍 f / 2 培养基，以维持培养基体积恒定（ 如未特别说 明，后续实验培养条件相同） 。
条斑紫菜甲醇提取物的抑藻作用 将甲 醇提取物的 DMSO 溶液用灭菌海水稀释，获得浓 度分别为 1、2、4、8 和 16 g DW / L 实验用液 1 000 mL，上述实验用液按 f /2 配方添加营养盐后，分 别移取 150 mL 至 250 mL 锥形瓶内。同时，设定 添加相同体积 DMSO 的新鲜海水配制的 f /2 培养 基为对照组，每个锥形瓶设定 3 个重复，4 种赤潮 微藻的起始密度和培养 条 件 同 上。此 外，第 12 天，测定藻细胞叶绿素、蛋白质和多糖含量；并采 用测微物尺和测微目镜测定藻细胞大小，并用显 微照相（ 放大倍数 10 × 40） 获得细胞形态照片。
5期
孙颖颖，等：条斑紫菜提取物对 4 种赤潮微藻生长的抑制作用
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近海水域生态环境、人类生活和沿海水产业的可 持续发展造成了极大的威胁。针对赤潮的频繁 发生，研究 者 提 出 了 一 些 治 理 方 法，如 利 用 粘 土 矿物［15］、季 铵 盐 类 化 合 物［16］以 及 病 毒［17］、细 菌［18］等抑制或 灭 杀 赤 潮 微 藻。 这 些 治 理 方 法 的 研究取得了一系列成果，但鉴于外来添加物质可 能对海洋生态系统产生可知或不可预见的影响， 利用海洋环境中的生物因子进行赤潮的防控已 经越来越引起人们的重视［19］。其中，利用海藻与 微藻间的抑制作用来预防或控制赤潮是一个新 的研究方向［20 － 22］。条斑紫菜（ Porphyra yezoensis） 是江苏省近海养殖最普遍的一个经济种，具有较 高的商业价值［23］，它 适 应 于 高 营 养 盐 的 环 境，是 实现生物修 复 改 善 海 洋 环 境 的 理 想 品 种［24］。 然 而，目前尚未见有关条斑紫菜对赤潮微藻生长影 响的报道。
文章编号：1000 － 0615（2010）05 － 0796 － 11
DOI：10. 3724 / SP. J. 1231. 2010. 06705
条斑紫菜提取物对 4 种赤潮微藻生长的抑制作用
孙颖颖1 ， 刘筱潇1 ， 阎斌伦1* ， 王长海2，3
（1. 淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005； 2. 烟台大学海洋学院，山东 烟台 264005；
新鲜条斑紫菜于室温下完全干燥 4 d，将其 粉碎为 0. 3 mm 干粉。称取 250 g 干粉，每份 50 g 置于 500 mL 锥形瓶中，并分别加入 400 mL 石油 醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和甲醇。超声波常温提 取 2 h 后，用滤纸过滤除去残渣，并用 0. 22 μm 有 机系滤膜除去颗粒物。40 ℃ 下蒸发除去溶剂，获 得浸膏，称其质量后，用二甲基亚砜（ DMSO） 定容 至 10 mL，获得 5 种浓度为 5 000 g DW / L（ 干重） 的浓缩液。在无菌条件下，将浓缩液经0. 22 μm 有机系滤膜除去微生物，于 4 ℃ 冰箱备用。 1. 4 条斑紫菜甲醇提取物的液液分离
1 材料与方法
1. 1 实验材料 前沟 藻、米 氏 凯 伦 藻、塔 玛 亚 历 山 大 藻 和 中
肋骨条藻无菌株由中国海洋大学提供，经进一步 分离纯化后由烟台大学海洋生化工程研究所保 存，在 f /2 培养基［25］中培养，培养温度（20 ± 0. 1） ℃ ，光照强度 40 μmol / （ m2·s） ，光暗比 12∶ 12。
3. 大连理工大学环境与生命学院，辽宁 大连 116024）
摘要：研究条斑紫菜水溶性抽提液对前沟藻、中肋骨条藻、米氏凯伦藻和塔玛亚历山大藻等 4
种赤潮微藻生长的影响，在此基础上，利用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿和石油醚等有机溶剂浸
泡条斑紫菜干粉，经抑藻圈方法检测条斑紫菜水溶性抽提液的抑藻活性。通过测定藻细胞密
条斑紫菜来自于赣榆 条 斑 紫 菜 养 殖 基 地。
蒸馏水仔细冲洗后，用混合抗生素对藻体组织表 面作灭菌处理，再用灭菌海水漂洗 3 ～ 4 次，培养 于 f /2 培养基中，温度 （23 ± 1 ） ℃ ，光 照 强 度 3 000 lx，光暗比 8∶ 16。
天然海水经过脱脂棉和 300 目筛绢过滤，煮 沸、冷却，用玻璃纤维素膜（ Whatman GF / C，0. 22 μm 孔径） 过滤后，将 pH 和盐度分别调节至 8. 5 和 30 备用（ 本文实验所用海水均做如上处理） 。 1. 2 条斑紫菜水溶性抽提液的制备
Leabharlann Baidu
4 种赤潮微藻的生长，尤其是对前沟藻和米氏凯伦藻具有很强的抑制作用。在 5 种有机溶剂
提取物中，甲醇提取物的抑制作用最为明显。进一步研究发现此提取物对 4 种赤潮微藻的生
长抑制显著且具有浓度效应，在 16 g / L 时，此提取物对前沟藻、米氏凯伦藻、中肋骨条藻和塔
玛亚历山大藻的生长抑制率分别为 70. 5% 、79. 9% 、67. 1% 和 65. 1% 。同时，致使米氏凯伦
通过活性检测，确定了甲醇提取物具有最大 抑藻活性。分析其对实验微藻的叶绿素、蛋白质 和多糖含量等生理生化指标的影响后，进行液液 分离。用 90% 甲醇水溶液将其溶解，加入石油醚 萃取 3 次，减压蒸干得到石油醚相浸膏。萃余相 40 ℃ 下蒸发除去甲醇后，加入适量蒸馏水重新溶 解，然后加入乙酸乙酯萃取 3 次，减压蒸干得到 乙酸乙酯相浸膏。最后，加入适量正丁醇萃取 3 次，减压 蒸 干 分 别 得 到 正 丁 醇 相 浸 膏 和 水 相 浸 膏。4 种分离物分别溶解于适量的 DMSO 中，保 存于 4 ℃ 冰箱备用。 1. 5 抑藻实验
新鲜 条 斑 紫 菜 40 g，加 少 许 蒸 馏 水 研 磨 成 浆，用灭菌海水离心 3 次，得 50 mL 水溶性抽提 液，浓度为 800 g FW / L（ 湿重） 。将此水溶性抽提 液用灭菌海水稀释，依次得到浓度梯度分别为 2、 4、8、16 和 32 g FW / L 的实验用液，每个浓度梯度 的实验用液体积为 1 000 mL，上述实验用液按照 f /2 培养基添加营养盐备用。 1. 3 条斑紫菜 5 种溶剂提取物的制备
目前，世 界 各 地 海 岸 普 遍 存 在 赤 潮 现 象，对
收稿日期：2009-11-14
修回日期：2010-01-25
资助项目：人才引进科研启动项目（ KQ08001） ；江苏省海洋生物技术重点建设实验室开放课题（2008HS017） ；国家“十一五”科技支
撑计划（2006BAD09A01）
通讯作者：阎斌伦，E-mail：yanbinlun@ yahoo. com. cn
（ Fucus vesiculosus） 中分离出的聚酚能抑制陆兹单 鞭金藻（ Monochrysis lutheri） 的生长［9］；从 Ralfsia spongiocarpa 中 分 离 出 的 鞣 酸 对 Porphyrodiscus simulans 和 Rhodophysema elegans 有 强 烈 的 抑 制 作用［10］；Plocamium hamatum 产生的 单 萜［11］、川 蔓（ Ruppia maritimea） 产生的二萜［12］以及从小珊 瑚藻中分离出 的 溴 仿［13］同 样 能 够 抑 制 某 些 微 藻 的生长。从孔石莼体内也分离鉴定出能抑制赤 潮异弯藻的 9，12，15-十八碳三烯酸、6，9，12， 15-十八碳四烯酸和 5Z，8Z，11Z，14Z-二十碳四 烯酸等不饱和脂肪酸［14］。
本文以条斑紫菜为研究对象，首先分析条斑 紫 菜 水 溶 性 抽 提 液 对 前 沟 藻 （ Amphidinium hoefleri） 、米氏凯伦藻（ Karenia mikimitoi） 、中肋骨 条藻 （ Skeletonema costatum） 和 塔 玛 亚 历 山 大 藻 （ Alexandrium tamarense） 等 4 种赤潮微藻生长的 影响；随后，利用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿和石 油醚等有机溶剂浸泡条斑紫菜干粉，并采用抑藻 圈方法检测这些提取物的抑藻活性。在此基础 上，通过测 定 藻 细 胞 密 度 和 细 胞 体 积，观 察 藻 细 胞形态，分 析 藻 细 胞 内 叶 绿 素、蛋 白 质 和 多 糖 等 生理指标的变化，进一步分析抑藻活性最大的有 机溶剂提取物对 4 种赤潮微藻生长的影响。最 后，依次以 石 油 醚、乙 酸 乙 酯 和 正 丁 醇 为 提 取 溶 剂，采用液液分离法对此有机溶剂提取物进行分 离，并分析 所 获 得 的 提 取 物 对 前 沟 藻、米 氏 凯 伦 藻、塔玛亚历山大藻和中肋骨条藻生长的抑制作 用，以期为进一步研究条斑紫菜抑藻物质提供实 验基础和理论依据。
藻、中肋骨条藻和塔玛亚历山大藻等 3 种赤潮微藻体积变小，运动能力下降，藻细胞出现空洞、
细胞破碎和色素减褪等现象；4 种赤潮微藻细胞内的叶绿素、可溶性蛋白质和多糖含量显著减
低。通过液液分离法甲醇提取物进一步分离为石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相等 4 种
提取物。其中，石油醚相和乙酸乙酯相具有较强的抑制作用。
度和细胞体积，观察藻细胞形态，分析藻细胞内叶绿素、蛋白质和多糖等生理生化指标的变化，
对抑藻活性最大的提取物对前沟藻、米氏凯伦藻、中肋骨条藻和塔玛亚历山大藻赤潮微藻生长
的抑制作用进行分析，并依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇为提取溶剂，采用液液分离法对此
提取物做了进一步分离。结果表明，当条斑紫菜水溶性抽提液浓度超过 16 g / L 时能显著抑制
条斑紫菜 5 种溶剂提取物的抑藻作用 采用培养皿抑藻圈法［27］，检测 5 种有机溶剂提取 物对 4 种赤潮微藻生长的影响。f /2 培养基中加 入 1. 5% 琼脂制成平板（90 mm） 。在平板内，铺 设 30 mm 的圆形滤纸片（ 已浸润对数生长期的 4 种实验微 藻） ，于 滤 纸 中 心 滴 加 一 定 量 提 取 物。 同时，以滴加相同体积的 DMSO 为对照组，每个 培养皿设定 3 个重复。将培养皿放置于智能光 照培养箱内培养，24 h 后观察抑藻圈的大小（ 抑 藻圈大小为平均值 ± 方差表示）。