噬菌体及其研究进展

简例
蒋鲁岩等用此方法快速检测食品源沙门氏菌，检测灵敏度 达10 CFU/100μL;120份食品样品中沙门氏菌的O-I噬菌体 检测与生化鉴定结果的阳性率分别为9.17%和10%,符合率 为91.7%。表明用荧光标记的O-I噬菌体可以快速、直观、 准确、大量地检测食品中沙门氏菌。
3.1.3报告基因检测技术
利用噬菌体展示技术制备抗体、模拟抗原表位，不仅绕过 了细胞融合，而且可以以单克隆抗体（McAb ） 或单链抗 体（ ScFv）为靶分子筛选真菌毒素的模拟抗原表位，代 替真菌毒素的标准品，建立无毒 ELISA检测方法，保证实 验操作人员和相关研究人员的人身安全。 熊啸（2007 年）等选用抗黄曲霉毒素M1（antiAFM1,Aflatoxin M1,AFM1）单克隆抗体为筛选配基，从噬 菌体表面展示的随机 7 肽库中筛选出 AFM1 抗原的模拟表 位LTSFPRH 和MAPSSWR，为研制出安全无毒的 ELISA 试剂 盒奠定基础。
烈性噬菌体 : 能在宿主菌内复制增殖，产生许多子代噬菌
体，并最终裂解细菌。 温和噬菌体（溶原性噬菌体）：噬菌体基因组整合于宿主 菌染色体中，不产生子代噬菌体，也不引起细菌裂解，但 噬菌体 DNA 随细菌基因组的复制而复制，并随细菌的分裂 而分配至子代细菌的基因组中。
生物合成 装配 释放
烈 性 噬 菌 体 的 溶 菌 周 期
现存的检测方法包括传统的细菌分离培养法、多聚酶链式反 应(PCR)法、生物芯片技术和免疫学方法等。 缺点：费时费力、价格昂贵、特异性或灵敏度低、国内试剂 供应不配套等，很难适应公共卫生事件应急处理快速反应的 需要。 有必要寻找一种简捷、快速、灵敏度高的检测食源性病原微 生物的方法以及技术平台。
检测方法
Masahito等将绿荧光蛋白(GFP)基因分别插入到T偶数型噬菌体PP01 的外壳蛋白(SOC)基因的C 末端和N 末端，构建成噬菌体PP01-GFP/SOC 和PP01-SOC/GFP，这种对E.coli O157:H7特异的噬菌体能够成功检测 菌体的可培养细胞，不可培养但可存活细胞(VBNC)及经过巴氏消毒过 的细胞，灵敏度高，检测时间仅为20min。
噬菌体及其应用
Contents
1 2 3 4 噬菌体简介 噬菌体应用技术简介 噬菌体在食品产业中的应用
前景及展望
1、噬菌体简介
概念：噬菌体是感染细菌、 真菌、螺旋体、支原体、 立克次体及放线菌等微生 物的病毒,属非细胞微生 物。 特性： 个体微小，需用电镜观察， 可以通过细菌滤器； 没有完整的细胞结构，由 核酸和蛋白质组成； 专性活细胞内寄生,具有 严格的寄生特异性。
噬菌斑检测
荧光染料标记
报告基因检测
3.1.1噬菌斑检测
原理：用噬菌体截获某种 病原菌，随后病原菌被噬 菌体感染，用杀毒剂将胞 外的剩余噬菌体杀死，然 后将噬菌体与被感染细胞 混合并在装有软琼脂的双 层培养基上培养，被感染 的细胞破裂释放出子代噬 菌休，在培养基中就会形 成空斑。
实验方法
标本采集后置于SC 增菌管中37 ℃ 增菌18 h左右, SS 平 板分离培养37 ℃ 过夜, 然后挑出具有沙门氏菌特征的单 个菌落划线接种于普通琼脂平皿上, 每块平板划格后可接 种8 个菌落左右。 在每格中央用灭菌的毛细滴管滴上O-I噬菌体, 待溶液干 后置37 ℃ 6-8 h 培养或过夜, 观察噬菌体裂解情况。
3.1.2荧光染料标记法
原理 ： 选用一种合适的染色剂，噬菌体的核酸染色标记， 然后用标记过的噬菌体侵染相应的宿主菌，噬菌体吸附在 宿主菌表面后，随即将标记过的核酸注入宿主细胞，随着 越来越多的噬菌体核酸的注入，细胞内荧光随着荧光素的 增多而增强，借助荧光显微镜便能判定宿主菌的存在，从 而实现病原菌的检测。
4、前景及展望
噬菌体检测技术具有快速、准确而直观特点,具有很强的 优势,应用前景广阔。 噬菌体大规模应用技术尚不成熟,有关噬菌体的各种研究 正在开展,但是这些研究仍限于动物模型,且缺少统一的评 定指标。噬菌体技术存在很多缺陷，比如:噬菌体携带一 些毒素基因;噬菌体裂解细菌高度特异,作用谱很窄。这些 问题会导致实际过程中治疗的不稳定性和不安全性。 所以目前噬菌体在实践中的应用相对较少,研究空间较大。 相信随着噬菌体技术的不断发展和改善, 它将在生命科学 等各个领域产生深远的影响。
真菌毒素作为天然毒素广泛存在于谷物等食品中，世界很多国家 均有被污染的报告，由于真菌毒素属于痕量污染物，因此检测技 术主要有各类色谱法和利用抗体的免疫学方法。 其中高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱和质谱联用（GC-MS） 优点：灵敏度和可靠性都很高 缺点：样品处理繁琐，仪器昂贵，现场快速检测中难以普及使用 酶联免疫吸附检测技术(ELISA) 优点：可以同时大批量检测样品，携带方便，操作简便和经济, 常以试剂盒的形式出现且易商品化 缺点:目前用于ELISA 检测试剂盒的各类毒素的单克隆抗体(McAb) 主要来源于小鼠杂交瘤细胞，在筛选单克隆抗体生产杂交瘤细胞 株系上，需要做杂交融合，亚克隆筛选，是一个长期复杂的过程， 既耗费财力、物力，又浪费时间，且检测所用真菌毒素标准品价 格昂贵。
3、噬菌体在食品产业中的应用
食源性疾病病原的检测技术 作为食品添加剂 噬菌体展示技术检测真菌毒素
3.3 噬菌体展示技术检测真菌毒素
噬菌体展示技术(Phage display technology)是20 世纪 80 年代逐步建立并发展起来的一项分子生物学新技术。 它以噬菌体或噬粒为载体, 使外源肽或蛋白基因与噬菌体 表面特定蛋白基因在其表面进行融合表达, 进而通过亲和 富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体。
发现被O-I 噬菌体裂解的菌株, 马上挑取噬斑周围菌苔直 接做沙门氏菌A- F 多价血清凝集试验, 凝集阳性者即可 初步报告结果, 然后转种克氏双糖铁管作进一步鉴定分型。
简例
O-I噬菌体是作用于沙门氏菌属特异性噬菌体,染色体为双 链DNA,受体是宿主细胞壁上核心多糖的乙酰氨基葡萄糖。 应用O-I噬菌体进行饮食行业及公共场所从业人员带菌调 查结果表明, 沙门氏菌检出率为0. 131%, 与广东省报道 的0. 134%检出率相近, 说明O- I 噬菌体应用对沙门氏菌 的诊断具有较高的特异性和敏感性, 不失为大量从业人员 沙门氏菌调查的较为理想快速诊断方法。
以β- 半乳糖苷酶作为报告基因的快速检测技术
β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是一种催化β-半乳糖苷水解 反应的糖苷酶。 β-半乳糖苷酶的作用特性是随着水解反应底物的不同而改 变，邻硝基苯β -D- 半乳糖苷是检测中常用的灵敏基质， 它被β - 半乳糖苷酶水解后产生蓝色沉淀，该技术可以使 检测的灵敏度达到生物发光荧光素酶检测的水平。 Goodridge等设计了一个带有lacZ基因的T4噬菌体，用这种 噬菌体感染待测样品，并用化学发光基质作为检测基质， 研究人员成功检测了肉汤培养基中的 E.coli ，检测限仅为 102CFU/ml。然后，研究人员将最大概率数(most probable number ，MPN) 法应用到食源性病原菌检测中，检测水平可 降至10CFU/ml，用时仅1h。
DNA噬菌体
少数为环状单链 多数为线状单链
RNA噬菌体
少数为线状双链
化学组成
核酸：DNA或RNA,基因组大小为2-200kb，某些噬菌体基因 组中还含有异常碱基。 大多数为线状双链
DNA噬菌体
少数为环状单链 多数为线状单链
ห้องสมุดไป่ตู้
RNA噬菌体
少数为线状双链
按与宿主的相互关系，噬菌体可以分为两种类型： 烈性噬菌体，温和噬菌体（溶原性噬菌体）
3、噬菌体在食品产业中的应用
食源性疾病病原的检测技术 作为食品添加剂 噬菌体展示技术检测真菌毒素
3.2作为食品添加剂
美国食品和药物管理局批准了一种由噬菌体病毒混合而成的产 品，主要用于杀灭肉制品中的李氏杆菌。这是美国首次批准将 病毒用作食品添加剂。 美药管局专家称，该产品在制备过程中可能留有残毒，但试验 表明，这些微量的残毒不会引起任何健康问题。该产品包含6 种噬菌体病毒，可在熟肉片和香肠等包装前喷洒在这些肉制品 上，有效杀灭多种李氏杆菌，预防由这些细菌引起的食物中毒。 产品中所包含的噬菌体只会攻击李氏杆菌，对人体和植物细胞 都不会产生影响。
2、噬菌体的应用技术
测定辐射剂量 鉴定细菌分型
预防和治疗 传染性疾病
应用
检测基因 产物的活性
检测病原菌
筛选目的基因
3、噬菌体在食品产业中的应用
食源性疾病病原的检测技术 作为食品添加剂 噬菌体展示技术检测真菌毒素
3.1食源性疾病病原的检测技术
食源性疾病病原的检测技术是食源性疾病的预防与控制的关 健的技术环节。数据显示，每年大约有7600 万人因食用了 受污染的食物而患病，其中91% 是由于细菌污染造成。
简介
利用荧光素酶基因作为报告基因的快速检测技术
对于细菌来说，发光机理可用下式表述：
F M N H 2+ R C H O + O 2 → F M N + H 2O + R C O O H + h ν(490nm)
反应是在荧光素酶的催化下进行的。细菌的荧光素酶是一个7 7 k D 的 二聚体，其中包含α亚基( 4 0 3 7 k D ) 和β亚基(37kD)。 目前，生物发光基因(lux,luc)在报告噬菌体检测技术中应用最为广泛。 Waddell 等利用转座子致突变，将lucA和lucB基因插入到E.coli O157:H7的温和噬菌体φ V 1 0 中，构建了一个荧光素酶转座噬菌体， 这一噬菌体能够使E.coli O157:H7 在1h 内被成功检测，并报告出结果。
形态与结构
形态：蝌蚪形，微球形，细杆形
噬菌体颗粒在结构上有很 大差别，一般可分成三种 类型，即 无尾部结构的二十面体， 有尾部结构的二十面体和 线状体，迄今已知的噬菌 体大多数是有尾部结构的 二十面体。
头部
尾部
核酸：DNA或RNA,基因组大小为2-200kb，某些噬菌体基因 组中还含有异常碱基。 大多数为线状双链
该技术中，将一个报告基因通过噬菌体插入到目标菌体的 D N A 中，随着报告基因的表达，目标菌体便可快速得到 检测。 应用在这一技术的报告系统主要有原核生物和真核生物的 荧光素酶 (lux,luc) 基因，细菌冰核蛋白 (inaW) 基因， E.coliβ- 半乳糖苷酶(lacZ)基因和生物素亲和蛋白。报 告 噬 菌 体 已 经 能 够 成 功 检 测 许 多 菌 种 ， 如 E.coli,Salmonella.spp 等 。
简介
A图只有细菌,荧光视野里不见任何发光物质;B图中只有荧光标记O-I噬菌体,视野 下偶尔可见少量圆点状的荧光物质,不见菌形;C图是荧光标记O-I噬菌体和沙门氏 菌混合,可见大量杆状物,少量点状物,极少数彗星状杆状物,将杆状物质与沙门氏菌 的革兰氏染色形态进行比较,两者一致。 由此可推知,C图中杆形物是侵有荧光噬菌体的沙门氏菌,点状物是标记的O-I噬菌 体,结合B图可知彗星状杆形物是即将裂解的宿主菌。