乳酸脱氢酶同工酶的电泳分离
生化实验：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶
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净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离蛋白质的原理
净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子 进行的电泳，目的是为了保持蛋白质的天然构象、其亚 基之间的相互作用及其生物学活性。利用蛋白质分子中 所带净电荷、分子质量、形状的差异，在电场中泳动的 速度和方向不同，从而达到分离的目的。多数蛋白质的 pI在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中 进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁 移，称为阳极电泳；对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲 系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移，称 为阴极电泳。
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实验原理
▪ （一）聚丙烯酰胺凝胶电泳 ▪ 聚丙烯酰胺凝胶:
是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis) 在催化剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(TEMED)和过硫 酸铵(AP)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此 凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
▪ AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合 反应进行。
玻璃管上端的2cm处，加水封胶 ➢ 在室温中聚合5-10分钟 注意：制胶时避免产生气泡
准备电泳：
将凝胶玻璃管安装在电泳槽本体上 将凝胶玻璃
管从橡胶管上取下，去水，垂直插到电泳槽本体上， 旋紧。
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加样 取电极缓冲液加入上、下缓冲液
槽中，注意上槽液要高过电极，凝胶柱与下 液槽的缝隙处无气泡。凝胶柱上端灌满缓冲 液，用微量进样器吸取一定体积的样品溶液， 小心地将样品加在凝胶柱上端。
(Bis)
自由基
交联
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实验7 琼脂糖凝胶电泳法测定血清乳酸脱氢酶同工酶
（4）恶性贫血 溶血性疾病、幼红细胞贫血症LD活性极度 升高，伴有LD1明显升高，LD1＞LD2。
（5）骨骼肌损伤时LD4和LD5可发生增高。
[注意事项]
1．红细胞中LD1、LD2活性很高，因此必须避免标本溶血。 2．LD4与LD5对热很敏感，因此底物-显色液的温度不能过
6．区带观察 观察显色的区带情况（数目、深浅等）。 7．定量 将各区带切开，分别装入试管中，加入400g/L尿素
4ml，于沸水浴中加温5min，取出冷却后以 575nm波长比色。 空白管取大小相同但无同工酶区带的凝胶，用上述相同的方 法处理。比色后根据各管吸光度值计算各同工酶的百分含量。
[计算]
A总＝A1+A2+A3+A4+A5 式中，A1～A5为各同工酶区带的吸光度。 各同工酶百分率（%）为：
实验7 琼脂糖凝胶电泳法分离（测定） 血清乳酸脱氢酶同工酶
[原理]
乳酸脱氢酶（LD）广泛存在于人体各组织细胞中，以 肾、心肌、肌肉、肝、红细胞含量最多。LD是由两种不同 亚基（M和H）组成的四聚体，共有5种同工酶形式，按电 泳的快慢命名为LD1、LD2、LD3、LD4和LD5。
5种同工酶大体可分为三大类：第一类以LD1为主，主 要存在于心肌，含量最多，可占总LD的50%左右；第二类 以 LD5 为 主 ， 以 横 纹 肌 为 代 表 ， 肝 脏 中 也 有 ； 第 三 类 以 LD3为主，存在于脾、肺。各组织LD同工酶的类型、含量 均有所差异。LD同工酶的测定相对于总活性的测定更具有 组织器官特异性，灵敏度也更高。
高（<50℃），否则易使其变性失活，不能显色。 3．LD4和LD5对冷不稳定，易发生失活，故最好采用新鲜标
乳酸脱氢酶同工酶在临床上的应用
乳酸脱氢酶同⼯酶在临床上的应⽤乳酸脱氢酶同⼯酶在临床上的应⽤陆明旭（⼴西医科⼤学基础医学院⼴西青秀区530021）联系⽅式：152******** 摘要：本⽂通过阅读⼤量的⽂献资料⽽汇总乳酸脱氢酶同⼯酶在临床上的研究成果。
主要介绍了乳酸脱氢酶同⼯酶的性质以及其与各种疾病的诊断，以便乳酸脱氢酶同⼯酶在临床上得到更好的应⽤，更好地为病⼈服务。
关键词：乳酸脱氢没、同⼯酶、应⽤乳酸脱氢酶是糖醉解途径中⼀种重要的酶。
它可逆地催化下述反应：乳酸+辅酶Ⅰ在乳酸脱氢没的催化下可逆⽣成丙酮酸+还原酶Ⅰ1959年Markert（1）发现⽜⼼乳酸脱氢没（LDH）结晶经淀粉胶电泳，可分成五条区带，⾸先提出了“同⼯酶”的概念。
同⼯酶⼀般指在同⼀种属内, 能催化同⼀底物进⾏相同反应⽽分⼦结构和理化性质不同的酶。
⼀、LDH 同⼯酶的分布、组成和性质LDH ⼴泛分布于动物各种组织、植物和微⽣物之中。
⼈体以肾含量最⾼, ⼼肌、⾻骼肌次之, 红细胞的LDH 含量约为正常⼈⾎清的100 倍。
电泳法可将⼈和动物组织LDH 分离成五种同⼯酶。
靠近阳极⼀端的称LDH1 , 靠近阴极⼀端的称LDH5。
其余三种, 从阳极到阴极依次命名为LDH2 、LDH3和LDH 4。
⼈⼼肌、肾和红细胞以LDH1和LDH2 最多, 肝和⾻骼肌以LDH5 和LDH4 最多, 脾、胰、甲状腺、肾上腺和淋巴结等以LDH3最多。
这说明LDH同⼯酶的分布有明显的组织特异性。
LDH 同⼯酶的分⼦量都在140,000 左右,实验证明都是由四个亚单位组成的四聚体（表1）表⼀ LDH同⼯酶的亚单位组成为什么不同组织的LDH同⼯酶谱不同呢？主要是因为A、B两种亚单位的含量不同, ⼈⾻骼肌和肝细胞的A∶B为10∶1, ⽽⼈⼼肌为1∶20，肾为1∶10。
A亚单位和B 亚单位的⽣物合成分别受染⾊体上LDHA和 LDHB基因单位点的控制, 实验证明, ⼈LDHA位点位于第11 号染⾊体上, LDHB位点位于第12号染⾊体上（2）。
乳酸脱氢酶同工酶的电泳分离
实验内容
2.浓缩胶制备
浓缩胶溶液（ml）
蒸馏水 浓缩胶缓冲液 30%母液 TEMED 10%AP 7.7ml 1.25ml 1.0ml 0.03ml 0.1ml
摇匀，混匀，将胶灌在分离胶之上，并用蒸馏水封住胶 面，静置凝合后，倾去水层，用细条滤纸吸干残余水分。
实验内容
3.样品处理：取血清1ml，加入1ml样品缓冲液，混合 后供电泳使用。 4.加样：将凝胶管垂直插入电泳槽上，加样（每管 50ul，勿弄破胶面），然后在样品液层上小心地加入 电泳缓冲液（勿搅动样品层）。
1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。 2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质的 操作技术。
实验原理---乳酸脱氢酶同工酶
同工酶：来源于同一个体或组织，能催化同一反应，而蛋白结构 不同的酶。广义是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶
乳酸脱氢酶目前发现有五种同工酶，它们都能催化乳酸脱氢产生 丙酮酸，分别是 LDH 1、LDH 2、LDH 3、LDH 4、LDH 5。
,
ห้องสมุดไป่ตู้
根据五种同工酶分子结构以及理化性质的不同,pI各不相同,在同一 SDS-PAGE中,在电场中移动速度不同,可用电泳法将其分离。
生理及临床意义
1.在代谢调节上起着重要的 作用。 2.用于解释发育过程中阶段 特有的代谢特征 3.同工酶谱的改变有助于对 疾病的诊断 4.同工酶可以作为遗传标志， 用于遗传分析研究。
蛋白质所带电荷和数量相同分子形状不同用活性染色对ldh进行鉴定将凝胶浸泡在活性染色液中ldh与底物的反应用吩嗪二甲酯硫酸盐pms作为电子的中间载体氯化硝基四氮唑蓝nbt作为最终电子受体底物脱下的氢最后传递给nbtnbt被还原后产生蓝紫色的不溶于水的物质以对ldh定位
第四章实验五乳酸脱氢酶_LDH_同工酶的分离纯化
NAD+：10 mL NBT：10 mL PMS：2 mL 0.5 M PH7.6 Tris-HCl: 15 mL 0.5 M乳酸钠：15 mL 0.1NaCl：5 mL 去离子水：43 mL
共计100 mL
四、实验操作
1.样品处理：1 g 组织切碎，加 pH 7.4 Tris-HCl缓 冲液10 mL，匀浆，10,000 g ，4℃，离心10 min，上
离子交换剂结构：以Sephadex-QAE A-50为例
葡聚糖 -N+(CH3)3 –Cl基质 功能基团 平衡离子
电荷基团 反离子
离子交换剂的种类
1 按基质种类不同： 离子交换树脂，离子交换纤维素，离子交换凝胶等
2 按功能基团不同： 强酸型 含磺酸基团 (R-SO3H)， 中等酸型 含磷酸基团 (-O-PO2H4) 弱酸型 含酚基、羧基 强碱型 含季胺基团 [-N+(CH3)3]，弱碱型 含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2] 3 按平衡离子的性质不同：
ABC
D
E
A280
5 10 15 20 25 30 35 40 50
洗脱体积
4.聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定：活性电泳 只做分离胶，胶倒好直接插上试样梳，进行聚合
编号 1 2 3 4 5
总体积
溶液名称 30% Acr –0.8% Bis pH 8.9 Tris -HCl TEMED 10% AP H2O
三、实验试剂
1、20 mM Tris-HCl，pH 7.4缓冲液； 2、A液: 20 mM Tris-HCl，pH 6.3缓冲液 3、B液: A液含60 mM NaCl 4、C液: A液含100 mM NaCl 5、D液: A液含150 mM NaCl 6、E液: A液含240 mM NaCl 7、QAE-Sephadex A-50准备：取1克QAE-Sephadex A-50于烧杯中加入100 mL A
实验三十二聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶（活性染色鉴定
实验三十二聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶（活性染色鉴定法）目的要求(1)复习有关同工酶的知识．(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶、底物染色技术及有关原理.实验原理1959年Markert等用电泳的方法将牛心肌提纯的LDH结晶分离出5条区带，靠近阳极一端的称LDH₁,，靠近阴极一端的称为LDH₅，；其余3种，由阳极到阴极依次命名为LDH₂，LDH₃及LDH₄。
它们均具有LDH催化活性，从而首先提出了同工酶(1soenzyme)的概念．目前：已知LDH同工酶是由H亚基及M亚基按不同比例组成的四聚体，它们是H₄(LDH₁)，H₃M(LDH₂)，H₂M₂(LDH₃)，HM₃(LDH₄)及M₄(LDH₅)5种，这些LDH同工酶广泛分布于动物的各种组织以及微生物和植物中．心肌中以LDH₁，含量高，骨骼肌及肝中LDH₅含量高。
图是正常人血清、心肌和肝组织提取液的LDH同工酶图1.2.8 电泳模式图。
LDH同工酶底物染色显色反应如下：反应式中PMS为甲硫吩嗪(phenazine methosulfate)，NBT为氯化硝基四氮唑蓝(nitrroblue tetrazolium chloride)的缩写，它们都是接受电子的染料。
LDH与底物染色液在37℃温浴中脱下的氢最后传递给NBT生成蓝紫色的NBTH2称为甲 ，此物不溶于水，有利于显色后区带的保存，但可溶于氯仿及95%乙醇（9：1）的混合液。
因此，电泳后的显色区带可通过浸泡法浸出，于560nm比色，也可用光吸收扫描仪扫描得出LDH同工酶间相对百分含量。
目前，LDH及其同工酶检测已广泛用于临床，作为某些疾病鉴别诊断的依据，常用醋酸纤维素薄膜电泳，琼脂糖电泳及聚丙烯酰胺电泳分离LDH及其同工酶，这3种不同支持物电泳及染色原理完全相同，但灵敏度不同。
因而正常值不完全相同。
本实验用连续PAGE 法分离LDH及其同工酶。
试剂与器材（一）材料人（动物）未溶血新鲜血清，动物组织提取液[组织重量与组织匀浆缓冲液体积比为1：5或1：10（g/ml）]。
16-生物化学实验--醋酸纤维薄膜电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶
醋酸纤维薄膜电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶【目的】1 ．掌握电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶的原理与技术。
2 ．熟悉测定血清乳酸脱氢酶同工酶的临床意义。
【原理】体内 LDH 同工酶均由四个亚基组成。
亚基分二种，即“ H ” 亚基（多分布于心肌）与“ M ” 亚基（多分布于肌肉）。
根据亚基不同， LDH 同工酶分为以下五种（表 3-8 ）。
表 3-8 LDH 同工酶的分类与组成由于 LDH 同工酶的亚基组成不同，在 pH8.6 巴比妥缓冲液中所带电荷不同，通过醋酸纤维薄膜电泳可以将血清样品中的各种 LDH 同工酶彼此分开。
以乳酸钠（钾）为基质，在有氧化型辅酶Ⅰ 存在时， LDH 可是乳酸脱氢生成丙酮酸、使 NAD + 还原为 NADH+H + ， NADH+H + 又将氢传递给吩嗪二甲酯硫酸盐（ PMS ）， PMS 再将氢传递给氯化硝基四氮唑蓝（ NBT) ，使其还原为紫蓝色化合物，因此有 LDH 活性的区带即着紫色，生成颜色深浅与 LDH 活性成正比。
其反应如下：将电泳后的醋酸纤维薄膜与含有底物乳酸和显色剂的染色液一起保温，便可显示出血清 LDH 同工酶的谱带（图 3-8 ）。
将各谱带洗脱进行比色分析，即可求得各同功酶的相对百分比。
图 3-8 LDH 同工酶电泳图谱【器材】1 ．电泳仪2 ．电泳槽（用二层滤纸或纱布搭桥）3 ．恒温水浴4 ．分光光度计5 ．点样器6 ．白瓷盘7 ．玻璃板8 ．镊子【试剂】1 ． pH8.6 巴比妥电泳缓冲液（离子强度 0.05 ）巴比妥钠 20.6g ，巴比妥 3.68g ，蒸馏水加至 2 000ml 。
2 ． pH7.5 磷酸盐缓冲液（ 0.1M ）磷酸二氢钾 2.16g ，磷酸二氢钠 30.13g ，蒸馏水加至 1 000ml 。
4 ℃ 冰箱保存。
3 ．吩嗪二甲酯硫酸盐液吩嗪二甲酯硫酸盐 0.5g ，蒸馏水加至 500ml 。
4 ．氯化硝基四氮唑蓝液氯化硝四氮唑蓝 1.25g ，加入 pH7.5 的磷酸盐缓冲液至 300ml( 温水助溶过滤 ) 。
垂直板聚丙烯酰胺凝胶连续电泳分离乳酸脱氢酶同工酶(活性染色鉴定法)
电泳结果实例
1 2 3 4
LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1
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电泳装置
采用Pharmacia公司的SE250小型夹心式垂直 板电泳装置： 制胶装置 制备凝胶板 电泳装置 进行凝胶电泳 每组（2人）做一块胶，两组共用一套电泳装置， 两套电泳槽共用一台电泳仪。
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操作步骤
一、样品制备： 样品制备： 断脊椎处死小鼠，取适量小鼠骨骼肌、肝脏、 心肌和脑组织，加入5倍组织重的匀in，15 min)， 吸出上清液，加入等体积40 %的蔗糖（含少许溴酚 蓝）混匀，放置4℃冰箱中备用。
3
AP-TMTED催化体系 AP-TMTED催化体系
TEMED催化 生成硫酸自由基： 催化AP生成硫酸自由基 催化 生成硫酸自由基：
－ S2O82－
2SO4
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链： 单体并形成单体长链： 硫酸自由基的氧原子激活 单体并形成单体长链
Bis将单体长链间连成网状结构： 将单体长链间连成网状结构： 将单体长链间连成网状结构
10电荷因素蛋白质分子形状和大小相同所带电荷性质和数量不同分子大小蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同分子大小不同分子形状蛋白质分子所带电荷性质和数量相同分子形状不同电荷因素分子大小分子形状11连续系统是指电泳系统采用相同孔径的凝胶缓冲系统等条件下进行区带电泳是利用蛋白质分子的电荷效应进行分离凝胶的分子筛效应不明显一般只用于分离一些比较简单的样品缺点是分辨率不高
6
温度
分子氧
杂质
凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响
凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝 胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因 素。T为凝胶溶液中单体和交联剂的总质量浓度，C为凝胶溶液中交联 剂占单体和交联剂总量的质量分数。 b a+b C = × 100 % T = × 100 % a+b m 式中，a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)，m为溶液的 终体积(mL)。 凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时，凝胶脆且硬， 不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈 糊状；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹 性并且透明。
乳酸脱氢酶同工酶电泳结果
乳酸脱氢酶同工酶电泳结果摘要：1.乳酸脱氢酶同工酶电泳的简介2.乳酸脱氢酶同工酶结果分析3.乳酸脱氢酶同工酶的作用4.乳酸脱氢酶同工酶检测方法5.乳酸脱氢酶同工酶的临床意义正文：乳酸脱氢酶同工酶电泳结果是一种检测乳酸脱氢酶同工酶的方法，乳酸脱氢酶同工酶的检测方法包括电泳法、离子交换柱层析法、免疫法、抑制法和酶切法等，但迄今最好的和用得最多的是电泳法。
乳酸脱氢酶同工酶电泳（ldhisol）可将人组织中ldh 分离出5 种同工酶区带，它们分别是ldh1、ldh2、ldh3、ldh4、ldh5。
乳酸脱氢酶同工酶结果分析显示，不同疾病会导致不同同工酶的升高。
例如，急性心肌梗塞发作后，血清ldh1 和ldh2 活性均升高，但ldh1 增高更早，更明显，导致ldh1/ldh2 的比值升高；肝炎、急性肝细胞损伤及骨骼肌损伤时ldh5 都会升高；患活动性风湿性心脏病、急性病毒性心肌炎、溶血性贫血时，病人的血清ldh 同工酶的改变与心肌梗塞相似。
此外，ldh1/ldh2 比值>1 还见于溶血性贫血、恶性贫血、镰形细胞性贫血、肾脏损伤、肾皮质梗塞、心肌损伤性疾病、瓣膜病等。
乳酸脱氢酶同工酶的作用主要体现在对疾病的诊断和鉴别诊断上。
通过检测乳酸脱氢酶同工酶的水平，医生可以了解患者是否患有心脏疾病、肝脏疾病、骨骼肌损伤等疾病。
然而，乳酸脱氢酶同工酶水平的升高并不能确定具体疾病，还需要结合其他临床表现和检查结果进行综合判断。
乳酸脱氢酶同工酶检测方法有多种，其中电泳法最为常用。
电泳法通过对乳酸脱氢酶同工酶进行分离和检测，可以清晰地了解患者体内不同同工酶的水平，为临床诊断提供有力依据。
除了电泳法，离子交换柱层析法、免疫法、抑制法和酶切法等方法也可以用于乳酸脱氢酶同工酶的检测，但应用较少。
乳酸脱氢酶同工酶的临床意义在于对疾病的诊断和鉴别诊断。
通过检测乳酸脱氢酶同工酶的水平，医生可以了解患者是否患有心脏疾病、肝脏疾病、骨骼肌损伤等疾病。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶
6、电泳
将电泳槽架放入电泳槽内，倒入其余的电极缓冲液至正极槽(外槽)，按正负极位置放 上电泳槽盖，盖紧，并按正负极连接上电泳仪。用稳压挡将电压调至80V，待样品蓝带 全部进胶后，调高电压至150V，继续电泳，当指示剂溴酚蓝的蓝带泳动至胶底部并出胶 后半小时到40分钟，关闭电源，停止电泳，前后共约2.5-3小时。
CH2=CH
N, N’-甲叉 双丙烯酰胺
化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素 的影响：
催化剂和加速剂的浓度 应选择合适的和浓度使聚合时间控制在30—60内较好，过量 的催化剂和加速剂会引起烧胶和蛋白质条带的畸变。
只能以游离碱的形式发挥作用，在酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发产生自 由基的过程会被延迟，聚合时间延长。
聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离乳酸脱氢酶同工
酶
样品的消化（为下周实验做准备）
• 每2组取3支消化管，按下表操作
•
编号
1 （空白） 2（样品） 3（标准）
• 试剂处理
• 样品液
—
1
—
• 标准磷原液
—
—
1
• 去离子水
1
—
—
• 524
2
2
2
•
•
加小漏斗，300℃加热沸腾10分钟，250℃左右继续
•
消化3～4小时至溶液透明，冷却，待用。
蛋白质为例，根据已学生化知识，蛋白质在小于或大于其等电点的时，可带不同的净电荷， 所以也有电泳现象。不同蛋白质质点带电性质、带电量多少、质点大小、形状都不同，决定 了各自在电场中移动速率和距离不相同，因而互相之间得以分离。
北师大版高中生物选修1：生物技术实践【实验】乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离
(3)溴酚蓝为什么能作为乳酸脱氢酶同工酶的指示剂？ 答案 溴酚蓝能和乳酸脱氢酶同工酶发生特定的反应， 形成特殊的蓝紫色产物。 归纳提炼 1．实验步骤概括 取材→剪碎→漂洗→匀浆→离心→制凝胶→加样→ 电泳→染色→冲洗→观察。
2．实验操作要点 (1)所有提取乳酸脱氢酶同工酶用到的器具最好都提 前在冰箱中预冷处理，这样能更好地保持酶的活性。 (2)蛋白质样品在上样之前，要与等量载体缓冲液混 匀。载样缓冲液中的蔗糖可增加蛋白质样品的比重， 防止加样时发生“漂样”现象；溴酚蓝作为一种电泳 前沿指示剂，判断电泳的进行程度。 (3)将蛋白质样品加在电泳槽的负极段的加样孔，因 为在碱性缓冲液中带负电荷的蛋白质在外加电场作 用下会向正极移动。
3．结果分析
由图中电泳结果可以看出： (1)每个器官形成了_5_个条带说明_乳__酸___脱__氢__酶__有__5_种__同__工__酶__。 (2)LDH2 在_心__脏__中含量最高，在_骨__骼__肌___中含量最低，说明 ___不__同__的__器__官__同__一__种__同__工__酶__的__含__量__不__同____。 (3)骨骼肌中含量最高的是_L__D_H__5_，含量最低的是_L__D_H__1__， 说明__同___一__器__官__不__同__的__同__工__酶__含__量__不__同____。
放入电泳槽中，然后向电泳槽中加入适量 ___T_B_E__电__泳__缓__冲___液(如图 3)。
(2)加样：取适量同工酶提取液与等量__载__样__缓__冲___液(质 量分数 40%的蔗糖溶液、0.25%溴酚蓝)混匀，然后取 20 μL 加入_样__品__孔___内。 (3)电泳：_1_0_0___ V 条件下电泳 30 min。 (4)染色：当溴酚蓝指示剂电泳到__凝__胶__底__部___时切断电 源，取出胶板浸入__染__色__液__中，37 ℃染色 15～30 min， 水洗后观察电泳结果。
乳酸脱氢酶同工酶电泳结果
乳酸脱氢酶同工酶电泳结果乳酸脱氢酶同工酶电泳是一种常用的实验方法，用于分离和研究乳酸脱氢酶的不同同工酶。
乳酸脱氢酶是一种重要的酶，广泛存在于动植物细胞中，并参与细胞内的代谢过程。
乳酸脱氢酶同工酶在不同生物体和不同组织中具有差异，通过电泳我们可以将这些同工酶进行分离和鉴定。
乳酸脱氢酶同工酶电泳的原理是利用酶的电荷和质量的差异，通过所施加的电场使得不同同工酶迁移速率不同，从而达到分离的目的。
在实验中，我们首先需要提取样品中的乳酸脱氢酶，并进行纯化，使得我们得到纯净的酶样品。
接下来，我们制备一块凝胶，常见的凝胶材料有聚丙烯酰胺和琼脂糖，凝胶的浓度会影响到同工酶的分离效果。
然后，在凝胶上制备多个凹槽，将经过纯化的酶样品加入凹槽中。
最后，施加电场使得酶样品迁移，然后进行染色和显影，可以观察到不同的带状图案，代表着不同的同工酶。
乳酸脱氢酶同工酶电泳的结果解读是关键的一步。
通过观察电泳结果，我们可以看到不同的带状图案，每个图案代表着一个同工酶。
通常情况下，我们会进行几个辅助的步骤来帮助我们解读结果。
首先，我们会制备一个标准品，其中包含已知的乳酸脱氢酶同工酶，这样可以帮助我们确定不同的同工酶的位置。
接下来，我们会进行图像分析，通过计算每个同工酶的迁移距离和分离度，来得到不同同工酶的相对表达量。
最后，我们可以进行统计学分析，比如聚类分析、主成分分析等，来对结果进行进一步的解释和研究。
乳酸脱氢酶同工酶电泳结果的意义非常重大。
首先，通过电泳，我们可以将乳酸脱氢酶的不同同工酶进行分离，得到它们在电泳图上的位置，这有助于我们了解不同同工酶的存在和表达情况。
其次，同工酶的分离和鉴定可以为我们研究酶的功能和结构提供重要的线索。
通过比较不同样品中同工酶的表达差异，我们可以进一步探索其与生理状况、疾病发生等之间的关系。
此外，乳酸脱氢酶同工酶电泳还可以用于品种鉴定、亲缘关系分析和种群遗传结构等方面的研究。
总结一下，乳酸脱氢酶同工酶电泳是一种有效的实验方法，通过分离和研究乳酸脱氢酶的同工酶，可以帮助我们了解同工酶的存在和表达情况，揭示酶的功能和结构，以及在种群遗传结构等方面的应用。
LDH
1
一、目的要求
学习和掌握琼脂糖凝胶电泳分离乳酸脱氢酶 同工酶的原理和方法
2
二、实验原理
琼脂糖凝胶分离各组分后，用活性染色鉴定 琼脂糖凝胶分离各组分后，
3
1、关于乳酸脱氢酶 、
1959年Markert等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱 年 等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱 氢酶(LDH)分离出 条区带，由阳极到阴极依次命名为 分离出5条区带 氢酶 分离出 条区带，由阳极到阴极依次命名为LDH1、 LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，它们均具有 它们均具有LDH催化活性， 催化活性， 催化活性 同工酶的概念 同工酶是由H 从而首先提出了同工酶的概念。目前已知LDH同工酶是由 同工酶是由 从而首先提出了同工酶的概念。目前已知 亚基按不同比例组成的四聚体。 和M亚基按不同比例组成的四聚体。 亚基按不同比例组成的四聚体
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1、关于乳酸脱氢酶 、
LDH升高而且 升高而且LDH1>LDH2，可见于心肌损 升高而且 ， 急性心肌梗塞、心肌病、溶血性贫血、 伤、急性心肌梗塞、心肌病、溶血性贫血、 恶性贫血、肺栓塞等。 恶性贫血、肺栓塞等。 LDH5升高而且 升高而且LDH5>LDH4，可见于肝硬化、 升高而且 ，可见于肝硬化、 肝癌、急性肝炎、肌炎、骨骼肌损伤。 肝癌、急性肝炎、肌炎、骨骼肌损伤。 LDH5>LDH4都升高以 都升高以LDH4更明显，可见于 更明显， 都升高以 更明显 阻塞性黄疸。 阻塞性黄疸。
LDH同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物各组织中LDH 同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物各组织中 同工酶广泛存在于动植物及微生物中 同工酶各组分含量不同。临床上对LDH及同工酶的检测可作 同工酶各组分含量不同。临床上对 及同工酶的检测可作 为某些疾病诊断的依据之一。 为某些疾病诊断的依据之一。
乳酸脱氢酶同工酶电泳结果
乳酸脱氢酶同工酶电泳结果摘要：一、乳酸脱氢酶同工酶电泳简介二、乳酸脱氢酶同工酶电泳结果分析1.LDH1和LDH2的升高2.LDH5的升高3.LDH1/LDH2比值的意义三、乳酸脱氢酶同工酶电泳的临床应用1.急性心肌梗塞的诊断2.肝炎和肝损伤的诊断3.骨骼肌损伤和疾病的诊断正文：乳酸脱氢酶同工酶电泳（LDHI）是一种检测血清中乳酸脱氢酶同工酶活性的方法，对于诊断某些疾病具有重要的临床价值。
本文将介绍乳酸脱氢酶同工酶电泳的基本原理和结果分析，以及其在临床上的应用。
一、乳酸脱氢酶同工酶电泳简介乳酸脱氢酶（LDH）是一种的四聚体酶，由M型和H型亚基组成。
在电泳过程中，LDH同工酶会在聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离出来，通过观察各同工酶的分布和活性，可以对某些疾病进行诊断。
二、乳酸脱氢酶同工酶电泳结果分析乳酸脱氢酶同工酶电泳结果主要包括LDH1、LDH2、LDH3、LDH4和LDH5的活性分布。
其中，LDH1和LDH2的活性升高，常见于急性心肌梗塞发作后。
这是因为心肌细胞受损后，LDH1和LDH2会从细胞内溢出，导致血清中活性升高。
此外，LDH5的升高，常见于肝炎、急性肝细胞损伤及骨骼肌损伤等情况。
而LDH1/LDH2比值的升高，对诊断急性心肌梗塞具有较高的敏感性和特异性。
三、乳酸脱氢酶同工酶电泳的临床应用乳酸脱氢酶同工酶电泳在临床上的应用主要包括以下几个方面：1.急性心肌梗塞的诊断：乳酸脱氢酶同工酶电泳结果中，LDH1和LDH2的活性升高，以及LDH1/LDH2比值的增加，对诊断急性心肌梗塞具有较高的价值。
2.肝炎和肝损伤的诊断：血清中LDH5活性的升高，有助于诊断肝炎、急性肝细胞损伤等情况。
3.骨骼肌损伤和疾病的诊断：LDH1和LDH2活性的升高，可以作为骨骼肌损伤和疾病的辅助诊断指标。
总之，乳酸脱氢酶同工酶电泳作为一种检测血清中乳酸脱氢酶同工酶活性的方法，在临床诊断中具有一定的应用价值，尤其在急性心肌梗塞、肝炎和骨骼肌损伤等疾病的诊断中具有重要意义。
实验八 乳酸脱氢酶
实验八乳酸脱氢酶（LDH）同工酶的琼脂糖凝胶电泳一、实验目的了解琼脂糖凝胶电泳的方法和原理，学会分离LDH同工酶的方法。
二、原理同工酶是指能够催化相同的化学反应，但酶分子的结构理化特性乃至免疫学性质不同的一组酶，同工酶这种差异是由于酶蛋白的编码基因不同或基因相同但转录、翻译或后加工有别所造成的。
同工酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织，甚至同一组织或细胞的不同亚细胞结构中。
人们已发现几百种同工酶。
乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase LDH）是人们认识的第一个同工酶。
LDH是糖酉孝解中的一个酶，它催化的反应如下。
COOH COOHHO—C—H+NAD＋C＝O＋NADH＋H+CH3 CH3LDH有五种同工酶，分子量在13万～15万之间，由四个亚基组成。
LDH的亚基有两种类型，一种是心肌型亚基（H型）（B基因），另一种是骨骼肌型亚基（M型）（A基因）。
两类亚基以不同比例可组成五种四聚体。
即LDH1(H4)、LDH2(H3M1)、LDH3(H2M2)、LDH4(H1M3)、LDH5(M4)。
H型亚基与M型亚基的氨基酸组成有差异，前者含酸性氨基酸残基多，故LDH可用电泳的方法进行分离。
本实验用pH8.6的缓冲液，在此条件下电泳，LDH的五种同工酶均净带负电荷，向正极泳动，但LDH1最快，依次减慢，LDH5最慢。
在哺乳动物体内，一般厌氧性组织中，如骨骼肌、肝脏中，LDH5含量高；在非厌氧性组织中，如心、脑中，LDH1含量高。
本实验用琼脂糖凝胶，LDH的五种同工酶在琼脂糖凝胶板上分离后，进行酶促反应，使乳酸脱氢生成NADH，NADH将人工递氢体PMS还原，还原型PMS 最终将NBT还原。
NADH++H++PMS=====NAD++PMSH2PMSH2＋NBT======PMS＋NBTH2NBTH2为蓝色化合物。
三、实验器材（一）、仪器1、电泳仪1、水平电泳槽2、离心机3、玻璃匀浆器5、恒温箱6、微量移液器7、吸量管四、材料与试剂1、小白鼠（成年）2、白瓷盘3、剪子4、镊子5、载玻片6、滤纸7、生理盐水8、0.01mol/l pH7.4磷酸钠缓冲液：取0.01mol/L NaH2PO419ml和0.01mol/L Na2HPO481ml混合即可。
实验六.LDH同工酶的电泳分离.ppt
2. 显色：电泳终止前10 min，将凝胶缓冲液：显 色液：0.5 M 乳酸钠溶液=67:53 :20(V:V:V)的比例 配置染色液。
电泳结束后，取出载玻片，放入培养皿中。
在载玻片上滴上染色液，覆盖凝胶表面，37℃ 避光反应30 min，取出后仔细观察。
点样孔(样品端接 负LDH 4 3.9%
LDH 3 18.5%
LDH 2 42.8%
LDH 1 33.4%
溴酚蓝电 泳指示剂
+
心 35~70 28~45 2~16 0~6 0~5
肝
0~8
2~10
3~33 6~27 30~8
骨骼肌 1~10 4~18
8~38 9~36 40~97
正常血清 27.1±2.8 34.7 ± 4.3 20.9 ± 2.4 11.7 ± 3.3 5.7 ± 2.9
a
2
12
b
酶活性 酶活性
3
1 4 5
乳酸脱氢酶同工酶的电泳分离
一、实验原理
来源于同一个体或组织，能催化同一反应，而蛋 白结构不同的酶称为同工酶(isoenzyme) 。同工酶的蛋 白结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。因 此可用电泳或其它方法将它们分离开。
乳酸脱氢酶（LDH）同工酶，它们都能催化 乳酸脱氢产生丙酮酸，经电泳分离后，就有 5 个同 工酶区带。本实验用琼脂糖凝胶电泳法分离人血清 乳酸脱氢酶 5 种同工酶（LDH1、 LDH2、 LDH3、 LDH4、 LDH5）。
二、操作步骤 1. 琼脂糖凝胶的制备和电泳：将 0.8% 琼脂糖凝
胶在微波炉中加热融化，趁热将凝胶倒在载玻片上， 立即插入加样梳。凝胶凝固后，小心垂直拔出加样梳， 将载玻片放入电泳槽支架上（样品孔在阴极），小心 搭上滤纸。
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硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
实验原理--聚丙烯酰胺凝胶
Bis将单体长链间连成网状结构：Βιβλιοθήκη 聚丙烯酰胺凝胶类型：
1.连续系统 ：是指电泳系统采用相同孔径的凝胶.缓冲系统等条 件下进行区带电泳,是利用蛋白质分子 的电荷效应进行分离，凝 胶的分子筛效应不明显，一般只用于分离一些比较简单的样品， 缺点是分辨率不高。 2.不连续系统: 是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳 方式,在电泳分离过程中,由于浓缩胶的堆积作用,可使样品在浓缩 胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带,对样品进行浓缩,然后在一 定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离,既存在电荷效应,也有分子 筛效应。虽然制胶操作难度较大,但是它具有连续系统不可比拟的 优越性,分辨率高。 不连续电泳的四个不连续性 :凝胶浓度的不连续性；缓冲液离子 成分的不连续性；缓冲液pH梯度的不连续性；电位梯度的不连续 性。
乳酸脱氢酶同工酶的电泳分离
实验目的要求
1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。 2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质的 操作技术。
实验原理---乳酸脱氢酶同工酶
同工酶：来源于同一个体或组织，能催化同一反应，而蛋白结构 不同的酶。广义是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶
乳酸脱氢酶目前发现有五种同工酶，它们都能催化乳酸脱氢产生 丙酮酸，分别是 LDH 1、LDH 2、LDH 3、LDH 4、LDH 5。
蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳中的 分离因素
电荷因素：蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小：蛋白质分子形状和所带电荷和数量相同，分子大小不同
分子形状：蛋白质所带电荷和数量相同，分子形状不同
乳酸脱氢酶同工酶活性染色
用活性染色对LDH进行鉴定,将凝胶浸泡在活性染色液中,LDH与底 物的反应,用吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)作为电子的中间载体,氯化 硝基四氮唑蓝(NBT)作为最终电子受体,底物脱下的氢最后传递给 NBT,NBT被还原后,产生蓝紫色的不溶于水的物质以对LDH定位。
,
根据五种同工酶分子结构以及理化性质的不同,pI各不相同,在同一 SDS-PAGE中,在电场中移动速度不同,可用电泳法将其分离。
生理及临床意义
1.在代谢调节上起着重要的 作用。 2.用于解释发育过程中阶段 特有的代谢特征 3.同工酶谱的改变有助于对 疾病的诊断 4.同工酶可以作为遗传标志， 用于遗传分析研究。
7.染色：将剥出胶柱浸入染色液中，并在37度水浴中 保温至酶带显出，大约5-10分钟。
注意事项
1.封管要严，防止漏液。 2.固定玻璃管要竖直。 3. 凝胶制备时：TEMED和AP要后加，加入后 用玻棒缓慢匀速的混匀，避免有气泡产生。 4.配胶后立即灌胶。
实验内容
2.浓缩胶制备
浓缩胶溶液（ml）
蒸馏水 浓缩胶缓冲液 30%母液 TEMED 10%AP 7.7ml 1.25ml 1.0ml 0.03ml 0.1ml
摇匀，混匀，将胶灌在分离胶之上，并用蒸馏水封住胶 面，静置凝合后，倾去水层，用细条滤纸吸干残余水分。
实验内容
3.样品处理：取血清1ml，加入1ml样品缓冲液，混合 后供电泳使用。 4.加样：将凝胶管垂直插入电泳槽上，加样（每管 50ul，勿弄破胶面），然后在样品液层上小心地加入 电泳缓冲液（勿搅动样品层）。
实验内容
分离胶的制备
浓缩胶的制备
待分离样品的处理
加样
电泳
染色
实验内容
1.分离胶制备
分离胶溶液（ml）
蒸馏水 分离胶缓冲液 30%母液 TEMED 10%AP 6.2ml 1.25ml 2.5ml 0.03ml 0.1ml
摇匀，混匀，并用蒸馏水封住胶面，静置凝合 后，倾去水层，用细条滤纸吸干残余水分。
实验内容
5.电泳：凝胶管的上下端分别浸入上下槽缓冲液后， 接上电泳，上槽接负极，下槽接正极，开始电泳10分 钟内加电流1MA/每管，样品进入分离胶，电流升至 2MA/每管，电泳2-4小时，直到溴酚蓝前沿到达距凝胶 下端约 0.5 cm时，关闭电源， 停止电泳，取出凝胶 管。
6.剥胶：用带长针头的注射器针筒吸满水，然后将针 头沿着玻管壁把水推进并旋转玻管，使胶自由滑出。
实验原理--聚丙烯酰胺凝胶
是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis) 在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 (TEMED)作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。 TEMED催化AP生成 硫酸自由基：以AP为催化剂，以TEMED为加速 剂。