胰腺干细胞移植技术研究进展

胰腺干细胞移植技术研究进展

王磊¹赵玉沛¹章静波º

(¹中国医学科学院,中国协和医科大学,北京协和医院基本外科,º中国医学科学院,基础医学研究所细胞生物室)

关键词胰腺干细胞定向分化糖尿病

糖尿病是影响人类健康的主要疾病之一.胰腺内分泌B细胞功能下降所导致的胰岛素分泌不足、糖代谢紊乱是糖尿病的重要原因;细胞替代疗法是糖尿病治疗的重要方法.传统的细胞替代疗法)))胰岛移植存在供体数量不足和免疫排斥的问题,而胰腺干细胞移植有望克服上述缺陷.本文就胰腺干细胞的发育过程与培养技术、不同发育阶段的表面标志物,如何促进胰腺内分泌前体细胞增殖及胰腺干细胞移植尚存的问题、发展方向作一阐述.

干细胞是具有无限或较长期自我更新、定向分化能力的特殊细胞.根据分化能力的不同,干细胞可以分为三种:全能干细胞(能够产生胎盘滋养层在内的各种细胞)、多能干细胞(能够产生生殖细胞在内的各种细胞)、单一潜能干细胞(具有单一定向分化潜能,仅能够产生某种特定细胞).利用干细胞自我更新和定向分化的特性,可以为细胞替代疗法提供丰富的供体来源,有望从根本上解决糖尿病等疾病的治疗问题.在这里我们就胰腺干细胞的发育过程及糖尿病的干细胞移植治疗情况作一阐述.

一、糖尿病的传统治疗

糖尿病是一种以持续性高血糖为特征的内分泌障碍综合征.它是影响人类健康的主要疾病之一,可导致全身性代谢紊乱并继发眼、肾、神经、心血管等脏器损害,估计到2025年患者将超过3亿.理论上,胰腺内分泌B细胞功能破坏所导致的内源性胰岛素产量不足是糖尿病(尤其是1型糖尿病)的重要原因,细胞替代疗法(即补充B细胞的功能,如胰岛移植)较目前临床常用的胰岛素治疗具有一定的优势,但也存在难以克服的问题:¹供体数量严重不足,需12000个胰岛细胞/kg体重,即2~4个供体才能满足一个受体的需要;º免疫排斥问题,异体取得的胰岛都存在免疫排斥,而且许多免疫抑制剂本身(如糖皮质激素等)也有致糖尿病作用.据国际胰岛移植中心登记,胰岛移植一年后仅8.2%的患者无须再使用胰岛素.

一些替代胰岛移植的方法包括异种胰岛移植.可分泌胰岛素细胞株的建立等方法曾先后出现.其中异种胰岛移植常取自猪胰岛,来源虽然丰富但也带来了无法克服的逆转录病毒感染问题.利用内分泌肿瘤细胞或特殊的胰腺内分泌细胞可以建立起分泌胰岛素的细胞株: Knaac k报道胰岛素瘤细胞株B TC6-F7可以在连续传代55代以上、超过一年后仍能够正常分泌胰岛素[1];取自高胰岛素低血糖综合征患者的细胞株NISK9,转染相应的缺陷基因后即能正常分泌胰岛素[2].但是这些细胞株表型俱不稳定,易于丧失分泌胰岛素的功能.随着近年来干细胞移植研究的不断深入,人们试图从干细胞培养生成B细胞甚至完整的胰岛,从而为糖尿病治疗开辟新的途径.

二、胰腺干细胞的体内发育过程

胰腺发生于胚胎中胚层的前肠,由背胰芽和腹胰芽组成.背胰芽发生于E9.5(胚胎第9.5d)的背侧内胚层,腹胰芽发生于E10.5(胚胎第10.5d)的腹侧内胚层.腹胰和背胰中胰腺干细胞有不同的发育环境,背胰来源的胰岛在营养物质的刺激下分泌更多的胰岛素[3].

1.胰腺干细胞的早期发育

胰腺干细胞的早期发育是各种因子综合作用的结果.同源结构域转录因子(homeodomain transcription factor) Paradox家族成员Pdx1(胰十二指肠同源性因子,pancreas duodenum ho meobo x-1)是早期胰腺干细胞发育的主要因子.Pdx1的作用受到Sonic Hedge hog(一种强效的细胞间信号蛋白,属于Hedgehog家族的成员,能够促进细胞的生存、增殖和分化)的限制,只有在Sonic Hedgeho g受到抑制的区域,Pdx1才能促进胰腺的发生[4].Activin B作为

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转化生长因子的一种,与F GF2(纤维细胞生长因子2)共同作用抑制Sonic Hedge hog的表达,导致Pdx1的上调,胰腺干细胞才能够发生[4].除Pdx1外,还有Hlxb9等因子能够促进胰腺干细胞的发育.腹胰与背胰中干细胞的发生机制不同,与心源性间皮层来源的FGF和Ngn3(ne uro-genin3)有关.

2.胰腺干细胞的分化

Pdx1阳性细胞出现后,首先形成各种上皮细胞,然后进一步分化为导管上皮细胞和胰腺内外分泌细胞.导管上皮细胞的分化在E9.5-11.5停止,而内外分泌细胞继续分化;在E14.5的大鼠胚胎中可识别出外分泌细胞,同时在胰管周围出现内分泌细胞形成的细胞团.间质中的可溶性因子(如follista tin)能诱导外分泌细胞分化并抑制内分泌细胞分化,所以间质的去除往往可以导致B细胞的分化与发育成熟[5].在胰腺干细胞进一步向成熟胰岛发育的过程中,各种各样的细胞外基质和基质金属蛋白酶对于胰岛前体细胞的迁移(通过基底膜进入间质的过程)和分化甚至胰岛完整形态结构的形成都有重要意义.E18可以出现完整的胰腺构型.

三、胰腺干细胞的体外培养

干细胞的来源一般有三种:¹取自胚泡内细胞团的胚胎干细胞(ESC);º取自5~9周流产胎儿性腺的胚胎生殖细胞(EGC);»取自畸胎瘤细胞的胚胎性肿瘤细胞(ECC)[3].ESC、EGC是正常的双倍体细胞,具有多向分化能力且免疫原性较低,移植中应用较为广泛,其中ESC 是干细胞最重要的来源.干细胞的发育最初取决于自体调节因子(包括各种转录因子和细胞内时钟)及外在因子(细胞-细胞、细胞-基质之间)的相互作用,而进一步发育则依靠特异性分化诱导物质的存在与抑制因子的去除.在胚胎发育中,最先出现全能干细胞,然后发育成为各种成体细胞的干细胞与原始的生殖干细胞.

ESC来源的胰腺干细胞体外培养分为三个重要阶段:定向分化(direc ted differentiation)、分选纯化(cell so rt-ing)、细胞成熟(cell matura tion).由于仅有0.1%~0.5%的细胞自然分化为所需细胞,分选纯化成为关键[6].根据特定基因型的表达来纯化胰腺干细胞是目前比较成功的方法.除了检测本身的特有基因外(如胰岛素基因),还可以通过掺入耐药基因或其他信号进行分选纯化.So ria构建同时含目标基因(胰岛素基因)和耐药基因(耐潮霉素基因)的嵌合体,在潮霉素溶液中筛选能够同时表达目标基因和耐药基因的细胞,即可得到所需的胰腺干细胞[7].这个细胞分选系统还可以掺入Pdx1、PP(多肽)等胰腺内分泌细胞特有的基因.另一种方法是利用B 细胞含大量锌的特点,利用含锌螯合物的荧光染料(二硫腙或ne wport green)探针即能够探测到胚胎小体中B 细胞的存在和纯度[8].其他方法,如根据特殊荧光激活细胞分选的方法;添加特异的生长因子和成型素(mor-phogen)的方法;与需诱导的组织共同培养甚至直接将胚胎干细胞移植入特定器官的方法,也可以用于胰腺干细胞的分选纯化[9].最后,只有在各种因子(包括血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、胃泌素、表皮生长因子、肌动蛋白等)的作用下[6],胚胎干细胞才能分化为成熟的胰腺内分泌细胞并进一步形成完整的胰岛,对血糖进行精确的调节.

四、胰腺内分泌前体细胞的表面标志物

胰腺干细胞发育成为内分泌细胞的过程中出现的各种因子和膜蛋白是重要的表面标志物.转录中最早出现的因子是Pdx1,表达Pdx1的细胞能够产生包括内外分泌细胞和导管上皮细胞在内的各种胰腺细胞,如果缺乏Pdx1,胰腺不能正常发育并无法与其他器官分界.Pdx1对于胰腺发育的各期都有重要作用:胎儿期对于胰腺B 细胞的定向分化有重要意义,成人胰腺中局限于胰腺B 细胞及十二指肠上皮中,是胰岛素基因表达的关键因子.还有研究发现,成体胰腺中Pdx1与胰腺的再生关系密切.Bonner_weir S发现胰腺切除90%后,24小时即可出现Pdx1阳性的细胞,72小时后合成过程虽然停滞,但大量上皮细胞丧失了胰腺成体细胞的特征,表现为Pdx1阳性细胞[10].急性坏死性胰腺炎胰腺细胞再生过程中也发现大量Pdx1阳性的细胞.

能够同时表达Hnf6,Hlxb9,Hnf3B等转录因子的上皮细胞是胰腺内外分泌细胞共同的前体细胞.Hlxb9有利于胰腺上皮细胞的出芽;Hnf3B是内胚层细胞发育的关键因子,也是Pdx1的转化调节因子;而Hnf6是一种表达在内外分泌细胞前体中的同源基因(ho meobo x gene),能够促进Hnf3B、Ngn3的表达[3].

一组转录因子(ISL-1、Pa x4、Pax6、Nkx2.2、Beta2、Neuro D、Ngn3、Hes1等)的出现标志着胰腺内分泌细胞前体细胞的产生[3].ISL-1能够引发背胰芽的形成,对内外分泌细胞皆有作用;Pa x4、Pa x6是两种同源结构域蛋白,其作用为促进各种类型胰腺内分泌细胞的发育:Pax4促进B细胞和D细胞的发育(生长抑素分泌细胞),Pax6

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