突变体构建

突变体构建

1.定点突变：快速，高效，简便

设计原理：引物与模板链退火，pfu DNA聚合酶合成突变链。DpnⅠ酶体外降解非突变型质粒模板（甲基化质粒模板）

设计引物：

引物包含5’端重叠区和3’端延伸区。

引物长度：除突变点之外，两条引物的长度大约为30个核苷酸，5’端重叠区包含15-20个碱基，3’端延伸区包含至少10个碱基。

突变引物：突变点位于两条引物上，分别位于正向突变引物重叠区下游、紧邻重叠区；反向突变引物5’端。

退火温度的计算不包括突变碱基。如图：

5’’3’-TACTGGTACTAATGCGGTTCGCGC G

延伸区重叠区

2.嵌合型突变体的构建：

将一个基因与另一个基因，互换构建嵌合型突变变体，可以通过overlapping PCR的方法获得。

●原理：

比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。

A的序列为5-atgcatgctagctagaacgct acgctgactaccccctgatc-3，

B的序列为5-atgctagtagctagcccccc cc aggggataattttttaaaacg-3。

●首先我们要设计引物，假设引物的序列为：

A1:5-atgcatgctagctagaacgct-3

A2:5-ggggggctagctactagcat gatcagggggtagtcagcgt-3

B1:5-acgctgactaccccctgatc atgctagtagctagcccccc-3

B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3

（设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。）

●步骤：

（1）以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因

（2）回收A，B基因

（3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。