牛奶中酪蛋白的提取与分析

实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析

实验材料：牛奶

小组成员：

实验时间：

一：实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析二：报告撰写者三、小组成员

实验仪器

温度计、布氏漏斗（* ）、pH试纸（* ）、抽滤瓶（*）水浴锅、烧杯、量筒、表面皿（* ）、电子天平（* ）、2个1000ml的容量瓶（*）、2张醋酸纤维薄膜（2cm x 8cm厚度120nm）成品

（* ）、培养皿9 —10cm （* ）、毛细管（* ）、尺子、铅笔、单面刀片（* ）、镊子、普通滤纸

（* ）、

电泳槽、玻璃板8cm x 12cm （* ）、752型分光光度计（*）、细布（* ）0.5ml、1.0ml、2.0ml、

5.0ml的移液管、试管、试管架、

四、实验材料

牛奶（蒙牛特仑苏和伊利金典）

五、实验试剂

特仑苏400ml、金典200ml、1.66g巴比妥（* ）、12.76g巴比妥钠（* ）、0.5g氨基黑10B （* ）、50ml 甲醇AR (* )、100ml 冰醋酸AR ( *) 、95%的乙醇250ml (*)、95% 的乙醚100ml (* )、0.2mol/L的乙酸100ml （*）、0.2mol/L的乙酸钠100ml （* ）、25g氢氧化钠固体（*）标准酪蛋白、15mg五水硫酸铜（* ）、60mg酒石酸钾钠（*）

所需试剂配制方法：

乙醇乙醚混合液的配制：

从特仑苏和金典中提取的酪蛋白样品液1、2 的配制（2-9mg/ml）:

10ml95%的乙醇10ml95%的乙醚乙醇钠缓冲液的配制：0.2mol/L 的乙酸51ml 0.2mol/L的乙酸钠49ml 巴比妥钠缓冲液的配制：巴比妥1.66g 巴比妥钠12.76g 染色液的配制：0.5g氨基黑10B 50ml

甲醇AR 10ml冰醋酸AR 漂洗液的配制：45ml95% 乙醇AR 5ml冰醋酸AR 蒸馏水透明液的配制：25ml的冰醋酸AR 75ml 的无水乙醇AR 0.05mol/L氢氧化钠溶液的配制：16g的氢氧化钠固体定容至1000ml 10%氢氧化钠溶液的配制：5g

的氢氧化钠固体定容至50ml 双缩脲试剂的配制：_ 15mg五水硫酸铜60mg酒石酸钾钠-

标准酪蛋白溶液A的配制（10mg/ml）: 用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制10ml

配制乙醇乙醚1:1的混合液

配制pH4.6的乙酸钠缓冲液（0.2mol/l）

配制巴比妥钠缓冲液（pH8.6,0.06mol./L ）将上述二者混合后定容于1000ml

+40ml蒸馏水，混匀既得染色液

混匀得染色液

混匀得透明液

溶于5ml蒸馏水，在搅拌情况下，加入

10%氢氧化钠溶液3ml，用蒸馏水稀释到10ml，用棕色瓶避光保存

从特仑苏和金典中提取的酪蛋白样品液1、2 的配制（2-9mg/ml）:

用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制10ml

标准酪蛋白溶液B的配制（1500卩g/ml）:

用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制

从特仑苏和金典中提取的酪蛋白样品液3、4的配制（50-1500卩g /ml）:

用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制

七、实验目的

1. 掌握从牛奶中提取酪蛋白的方法

2. 了解蛋白质分离纯化的基本办法

3. 学习电泳的基本原理及掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离酪蛋白的具体操作

4. 掌握双缩脲法和紫外吸收法测定蛋白质含量的原理及操作方法并比较两种方法

5. 熟悉分光光度计的原理和操作

6. 比较特仑苏与金典中的酪蛋白含量

八、实验原理

酪蛋白在其等电点时静电荷为零，同种电荷的相互排斥作用消失，溶解度很低，利用这

一性质，将牛乳调节到PH4.6，酪蛋白就可以从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶解于乙醇，这

个性质被用来从酪蛋白中除去脂类杂质。

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酪蛋白并不是单一的一种蛋白质，而是多种性质类似的蛋白质的统称。其一般由

3 —, 丫一, K—4种类型组成。它们各自的等电点（pl）具有一定的差异，本实验将酪蛋白溶液点样于用

pH8.6（高于酪蛋白各型等电点）缓冲液浸泡过的醋酸纤维膜上，并在该缓冲液体系中进行电泳，使酪蛋白分子上带上不同量的负电荷，在电泳过程中酪蛋白分子由负极

向正极移动，同时酪蛋白各类型分子的相对分子量也不同，因此在电泳过程中其迁移率也不

同，从而把酪蛋白的各种类型分离开来。

白质分子中因含有两个以上的肽键，因此也能发生双缩脲反应。蛋白质在碱性溶液中与二价铜

离子产生紫红色络合物，其颜色的深浅在一定范围内与蛋白质的含量称正比，与蛋白质的氨

基酸组成及相对分子质量无关。故可用双缩脲反应来测定蛋白质的含量，测定范围为

0.5-10mg/ml 蛋白质。

由于蛋白质分子中含有的酪氨酸、色氨酸等残基中具有共轭双键，使得蛋白质在280nm

处具有最大吸收值，且其光吸收值与浓度在一定范围内成正比，因此，该法可用作蛋白质定

量测定。该法测定蛋白质含量时具有简单、灵敏、快速、不消耗样品、不受低浓度盐干扰等优点，但该法准确度较差，特别是如果样品中含有嘧啶、嘌呤等吸收紫外光的物质时，会出

现较大的干扰，这时，就需要通过紫外吸收差来求蛋白质浓度，但也存在着一定的误差。

九、实验步骤

（一）酪蛋白的提取

1、酪蛋白的等电点沉淀

做六组平行试验，每组分别：将100ml的牛奶放到500ml的烧杯中，加入40度

左右的乙酸钠缓冲液，直到pH达4.6左右，用pH试纸调试。将上述悬浊液冷却

至室温，然后放置5min，用细布过滤，收集沉淀。