金银花中总黄酮的提取及其抗氧化活性的研究

金银花中总黄酮的提取及其抗氧化活性的研究YANG Xin-jian1，DUAN Su-yun1，SONG Lin-lin2

1. 北京农业职业学院，北京102442，中国；

2. 河南科技学院，新乡，河南453003，中国

摘要：【目的】对金银花总黄酮抗氧化活性进行研究。【方法】采用乙醇提取法从金银花中提取总黄酮。采用烘箱法测定总黄酮的抗氧化活性；采用H2O2/Fe2+ 体系法检测其对羟基的清除作用、邻苯三酚法测定其对超氧阴离子的清除作用。【结果】金银花提取物对猪油的氧化有显著的抑制作用；其效果对羟基和自由基的清除率分别达到52.59%和17.12%。【结论】总黄酮具有明显的抗氧化、清除羟自由基以及清除超氧阴离子的能力。

关键词金银花，总黄酮，抗氧化活性，中国

金银花是忍冬花蕾，多年生半常绿缠绕。花茎是忍冬的藤，分布广泛，在中国大部分地区均有生产。金银花中含有有黄酮、木犀草素、绿原酸、异绿原酸等成分[1]，具有抗菌、增强抗体免疫功能的作用。金银花味甘、性寒，具有保护肝功能[2]。民间常喝金银花消暑[3]。

黄酮类化合物是一类具有2-苯基色原酮结构的化合物[4]。其中，第一个氧原子具有碱性，能和强酸反应生成盐，其羟基衍生物大多是黄色的。黄酮类化合物在植物体内与糖类结合成苷类；小部分以游离态的形式存在。大多数植物体内都含有黄酮类化合物。黄酮类化合物广泛分布，种类多样，具有多种生物活性。黄酮类化合物具有抗菌、消炎、镇静，利尿，抗氧化，抗癌，抗突变的作用，在解毒，降血压，清热和抑制脂肪酶等方面也有效果[5]。

黄酮类化合物在植物的生长，开花结果以及抗菌和疾病的预防等方面发挥重要作用。黄酮类化合物是一种具有发展前景的重要的天然有机抗氧化剂[6]。本研究对金银花的总黄酮提取及抗氧化作用进行了研究，旨在为金银花的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。金银花，购自新乡庞东来医药店，且经过鉴定。

1.1.2主要仪器。Sartorius BSA224s电子天平，购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；高速FW80型万能粉碎机，购自天津华鑫仪器厂；HH-4数显恒温水浴锅，购自江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；FD-1B-50冷冻干燥机，购自北京博医康实验仪器有限公司；RE-52C旋转薄膜蒸发器，购自巩义市英峪予华仪器厂；T6新世纪紫外可见分光光度计，购自北京普析通用仪器有限公司。

1.1.3主要试剂。乙醇、石油醚、氯仿、冰乙酸、硫代硫酸钠、硫酸亚铁铵、邻二氮菲、碘化钾、盐酸、过氧化氢、邻苯三酚；以上试剂为分析纯，市售；实验用水为去离子水，市售。

1.2方法

1.2.1金银花粉碎处理。将金银花铺成5毫米的薄层，于60摄氏度下在干燥箱内干燥1小时，然后用高速粉碎机进行粉碎并过50目筛，置于干燥容器备用。

1.2.2金银花总黄酮的提取。将称好的5.000g金银花粉末置于干燥的三口烧瓶中，按照料液比1:30（g/ml），提取时间8小时提取温度76摄氏度，乙醇浓度70%[7] 设定参数。放入恒温水浴锅中提取。之后，对提取物进行抽滤、旋转蒸发浓缩，石油醚脱色，将石油醚层回收溶剂，得到母液。

1.2.3金银花中醇提取物的冷冻干燥。将母液倒入培养皿中，置于冷冻干燥机，于-50摄氏度冷冻干燥12小时。然后，将干燥后的蓬松物质取出包好，放入干燥器皿中备用。

1.2.4金银花中总黄酮的抗氧化活性的研究。

1.2.4.1金银花总黄酮的测定。将添加了0，0.10%，0.20%，0,。30%和0.40%提取液的猪油放在60摄氏度左右的烘箱。每隔一段时间计算其POV值[8]。POV的计算公式为：

在式中：V1指样品中消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积（ml）；V2指空白试剂消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积（ml）；C指硫代硫酸钠标准溶液的浓度（mol/L）；M指样品质量（g）；126.9指碘的摩尔质量（g/mol）。

精确称取2~3g混合样品置于250ml碘液，加入30ml氯仿-冰乙酸混合液溶解样品。然后，加入1ml饱和碘化钾溶液。等待混合均匀后放置在暗处5分钟，再加水100ml。以浓度0.02mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡黄色，加1ml淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失为止。以空白试剂滴定为参比，测定V1和V2。

1.2.4.2金银花总黄酮对羟自由基的清除作用。将0.3ml浓度7.5mmol/L硫酸亚铁铵水溶液和浓度7.5mmol/L过氧化氢水溶液加入7支10ml的比色管中。同时也加入1.0mlTris-Hcl缓冲液（PH=7.47）。在2~7号比色管中各加入0.2ml浓度7.5mmol/L过氧化氢水溶液，然后在3~7号比色管中分别加入黄酮类化合物浓度为2mg/ml的黄酮提取液1.0，2.5，4.0，5.5和7.0ml。最后，用蒸馏水定容，于37摄氏度水浴1小时，在波长508nm处测吸光值（A），计算羟基自由基清除率[9]。清除率的公式为：

清除率（%）=（A样品-A损伤）/（A未损-A损伤）×100；

式中，A样品为加入提取液的羟基自由基体系，A损伤是加过氧化氢的吸光值，A未损是不加入过氧化氢的吸光值。

1.2.4.3金银花中总黄酮对超氧阴离子的清除作用。根据Wu Hui-ping的方法[10]，邻苯三酚在碱性条件下能发生自氧化，生成有色中间物（在420nm处有最大吸收峰）和超氧阴离子，超氧阴离子对自氧化起催化作用，根据有色中间产物生成量的多少，可判断超氧阴离子生成量的多少。实验体系为3mlTris-HCL缓冲液（PH=8.2），0.1ml不同浓度的样品，于25摄氏度水浴20分钟，加入3ml浓度为7mmol/L的邻苯三酚，反应4分钟，然后加入10mol/L的Hcl终止反应，于420nm波长处测吸光值，根据抑制率判断样品对超氧阴离子的影响[11]：抑制率（%）=[A对照-（A样品-A样品空白）]/A对照×100。

在式中A对照是抗坏血酸体系，A样品是加入提取物的吸光值，A样品空白是不加提取物的吸光值。2结果分析

2.1金银花总黄酮的POV的测定将添加0、0.10%、0.20%、0.30%和0.40%提取物的猪油样品置于60摄氏度的烘箱中，间隔一定的时间计算POV值。由图1可知，金银花总黄酮对氧化具有明显的抑制作用，且随着浓度的增大抗氧化性能力也随之增强。