第十七章 转基因育种技术

良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件： 1、必须具有脱分化和再生能力，能够形成新的植物体。高 效稳定的再生能力； 2、受体材料要有较高的遗传稳定性；
3、外植体来源方便，如胚和其它器官等；
4、对筛选剂敏感； 5、能够接受外源基因，并通过基因重组或其它途径使外源
基因稳定地插入植物染色体组,转化率高
Ti质粒是根癌农杆菌染 色体外的遗传物质，为双股 共价闭合的环状DNA分子， 约有150-200kb大小。在病 原菌致病过程中，其中的一 段DNA分子（T-DNA）能够 插入到植物基因组中并能够 稳定表达。
T-DNA 区
生长素合成基因 左边界
细胞分裂素合成基因 冠瘿碱合成基因 右边界 与 Ti 质粒转移功能
第十七章 转基因育种技术
第一节 转基因育种的概念
一、植物遗传转化（植物基因工程） 以植物为对象，采用重组DNA技术， 将外源目的基因导入受体植物基因组，最 后获得外源目的基因正确表达和稳定遗传 的新植物类型。 核心技术是重组DNA技术
重组DNA（recombinant DNA）：是指人工创造的自然界中 不存在的DNA分子。主要指利用不同生物来源的DNA分子拼 接的杂种DNA分子。
A.原生质体共培养法
该方法是Marton等1979年以原生质体为受体建立起来的， 随后经过一系列的改进，现在是植物基因工程中最常用的一种 转化方法。该方法的主要原理是将受体与供体在一起培养，通 过接触感染而发生转移，供体常用农杆菌、病毒载体等形式。 取含重组Ti质粒的农杆菌同刚刚长出细胞壁的原生质体 作短暂的共培养，促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物质 的转化。
根癌农杆菌Ti质粒介导的转基因方法是目前研究最多、机理最清 楚、技术方法最成熟的转基因方法。第一批表达外源基因的转基因植 物就是用根癌农杆菌介导法获得的。迄今所获得的200多种转基因植 物中，80%以上是利用根癌农杆菌Ti质粒介导的转基因方法产生的。
（2）农杆菌转化的方法
农杆菌转化首先要求植物外植体能够产生乙酰丁香酮或 其它能够诱导Vir区基因的活性物质。 其次是农杆菌能够接近具有再生能力的感受态细胞。
将两者紧密结合，可相得益彰，提高作物品种 遗传改良的效率。
第二节 目的基因的获得
根据获得基因的途径主要可以分为两大类： 根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆； 从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。
根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆 主要步骤如下： 分离蛋白质 明确氨基酸序列 推导核苷酸序列 人工合成
可用于农杆菌转化的外植体种类很多，从单细胞（通 常是原生质体）、悬浮培养细胞和愈伤组织（未分化的胚 性细胞）、薄壁细胞层、组织切片（如萝卜韧皮部和马铃 薯块茎薄壁组织）到各种植物器官，如叶、根、茎和花组 织的切段等。
基因转移技术的一般操作
以根瘤农杆菌转化双子叶植物叶片为例 1.将表面消毒的叶片切成小块 2.小块在过夜培养并稀释到一定浓度的根癌农杆菌液中浸泡 几分钟，以便让根癌农杆菌感染叶片切块的伤口。 3.从菌液中捞出小块，培养基中培养2天。 4.在含头孢霉素选择培养基中筛选转化细胞。继续培养，转 化的细胞分化出芽。 5.将芽转入含有抗生素的生根培养基上，诱导生根。 6.将完整的转基因植株移栽到土壤中。
优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定；
缺点：材料局限，转化率低。
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3.原生质体再生系统
原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早 的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得 基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合 体少，适用于多种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。
四、植物基因工程常用载体
• • • • 质粒(plasmid)； 病毒载体(virus vector)； 噬菌体(phage)； 酵母载体(yeast vector)；
以病毒载体和质粒载体介导的遗传转化比较多。
五、Ti质粒
有一种土壤细菌,称为农杆菌，它 能诱导植物伤口形成冠瘿瘤，细菌的 致瘤能力来源于细菌内的一个额外染 色体即质粒(plasmid)，称Ti质粒。 还有一种细菌称发根农杆菌,决定 毛根症的质粒为Ri质粒，即诱发寄主植 物产生毛根 . Ti和Ri质粒是理想的基因克隆载体， 通过它们可以将外源的DNA转移到植物 细胞，并再生出能够表达外源基因的 转基因植物。
致毒区
有关的遗传座位 冠瘿碱代谢 酶编码基因 Ti 质粒复制起始点
不同类型的Ti质粒都具有:
（1）T－DNA区（transferred-DNA T-DNA 区 regions）： 细胞分裂素合成基因 生长素合成基因 冠瘿碱合成基因 T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时 左边界 右边界 ，从Ti质粒上切割下来转移到植物 与 Ti 质粒转移功能 细胞的一段DNA，故称之为转移 有关的遗传座位 致毒区 DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤 冠瘿碱代谢 的形成有关。 酶编码基因 （2）Vir区（virulence region）： Ti 质粒复制起始点 该区段上的基因能激活T-DNA转 移，使农杆菌表现出毒性，故称之 为毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒 DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一。
就非载体转化而言，该系统又可以分为两种类型： 种质转化系统和直接转化系统。 种质转化系统：以植物自身的生殖系统种质细胞，如花粉 粒通道法。 直接转化系统：不用任何载体，采用物理化学方法直接将 外源基因导入受体细胞，如基因枪法、脂质体法、超声波 法等。
一、载体介导的转化方法
1、农杆菌介导的基因转移 （1）农杆菌转化的寄主范围
第一，传统技术一般 只能在生物种内个 体间实现基因转移 ，而转基因技术所 转移的基因则不受 生物体间亲缘关系 的限制。
第二，传统技术是在生 物个体水平上进行， 操作对象是整个基因 组，所转移的是大量 的基因，不可能准确 地对某个基因进行操 作和选择，对后代的 表现预见性较差。 转基因技术转移的是 经过明确定义的基因 ，功能清楚，后代表 现可准确预期，因此 ，转基因技术是对传 统技术的发展和补充 。
二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花
粉管导入法、花粉粒浸泡法、子房微针注射法等。
优点：生殖细胞不仅具有全能性，而且接受外源遗传 物质的能力强，导入外源基因成功率高，更易 获得转基因植株。又因生殖细胞是单细胞，转 化的基因五显隐性影响，外源目的基因充分表 达。因此利用生殖细胞作为转基因受体与单倍 体育种技术相结合，可简化和缩短育种纯化过 程。 缺点：获得单细胞只能在开花期，常受到季节及生长 条件的限制。
二、转基因育种 将植物遗传转化和常规育种技术相结合， 培育具有特定目标性状的植物新品种。
转基因育种技术的一般实验流程
目的基因的克隆与鉴定
生理检测
纯化
转化载体的构建
E.Coli转化，质粒
抽提与鉴定
移栽
分子检测
继代繁殖 农杆菌的转化与活化
外植体制备
选择培养
浸
染
共培养
转基因技术与传统技术的关系
二者本质都是通过获得优良基因进行遗传改良。 在基因转移的范围和效率上有两点重要区别：
T-DNA 区
生长素合成基因 左边界
细胞分裂素合成基因 ห้องสมุดไป่ตู้瘿碱合成基因 右边界 与 Ti 质粒转移功能
致毒区
有关的遗传座位 冠瘿碱代谢 酶编码基因 Ti 质粒复制起始点
第五节 基因转导方法 将目的基因导入受体细胞（植物细胞）
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
遗传转化分为两种： 一种是生物载体介导的遗传转化； 一种是非生物载体介导的遗传转化。
致毒区
有关的遗传座位 冠瘿碱代谢 酶编码基因 Ti 质粒复制起始点
根据其诱导的植 物冠瘿瘤中所合成的冠 瘿碱种类不同，Ti质粒 可以被分成四种类型： 章鱼碱型 胭脂碱型 农杆碱型 农杆菌素碱型 （或称琥珀碱型）
T-DNA 区
生长素合成基因 左边界
细胞分裂素合成基因 冠瘿碱合成基因 右边界 与 Ti 质粒转移功能
烟草原生质体与Ti质粒转移的共培养法程序为：
①从烟草无菌苗中分离原生质体，并预培养24小时。
②原生质体与农杆菌混合培养，原生质体浓度 l05／ml、农杆 菌l07／ml，20℃下保温32小时。
③冲洗去游离的细菌，将原生质体培养在有抗生素(250mg／ L万古霉素，200mg／L羧苄青霉素， 200mg／L链霉素)的培 养基中，这些抗生素抑制细菌生长，而对原生质体无毒害。 ④3周后，离心收集细胞团，再培养在无激素培养基上，2周 内，转化的细胞团是激素非依赖性生长细胞团，在该培养基中 可快速生长，而非转化的细胞团则生长很慢，最后变褐死亡。
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常用的受体材料有以下几大类型: 1.愈伤组织再生系统
外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（带有目
的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。
优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。 缺点：遗传稳定性差、嵌合体，因此需要连续的再生系统
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2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直 接分化出不定芽形成再生植株。 现已建立了一些植物幼芽、胚轴、茎尖分生组织等外植体 诱导形成直接分化芽再生体系。
其过程包括如下几个步骤： – 从细胞或组织获得DNA并纯化 – 用限制酶切割DNA
– 将获得的限制片段连接到载体上， 外源DNA片段与载体连接后形成的 杂种DNA分子称为重组DNA分子 – 重组DNA导入宿主细胞，在宿主细 胞内重组DNA分子复制，产生大量 相同拷贝的重组DNA分子，称为克 隆 – 克隆的DNA分子可以从宿主细胞中 回收，纯化 – 克隆的DNA可以转录和翻译，其产 品可以被分离出来用于研究或商业 开发
（3）Con区（regions encoding conjugations）： 该区段上存在着与细菌间接 合转移相关基因（tra），调 控Ti质粒在农杆菌之间的转移 。冠瘿碱能激活tra基因，诱 导Ti质粒转移，因此称之为接 合转移编码区。 （4）Ori区（origin of replication ）： 该区段基因调控Ti质粒的自 我复制起始。
利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。 虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。 局限性：兼并密码子 效率低 未知基因及产物
第三节 植物遗传转化的受体系统
受体:是指用于接受外源DNA的转化材料。 受体系统:是指用于基因转化的外植体通过细胞或其 他组织培养途径，能高效、稳定地再生无性 系，并能接受外源DNA整合、转化选择对抗 生素敏感的再生系统。 转化的主要目的:外源DNA稳定地插入植物细胞的染 色体组中，并再生出完整的植株。
第四节 植物遗传转化的载体系统
一、载体的概念
载体（vector）:将外源基因送入受体细胞的工具
本质是一段DNA分子,是指能在连接酶作用下和外源DNA片段或基因连接 ，并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。
二、载体的功能 作为植物基因转化的载体，必须具有两种功能： 一是它能作为媒介将外源基因导入到植物细胞中去，并且整 合到宿主细胞的基因组DNA上 二是它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的DNA序 列，即启动子和复制子起始位点，以保证转化的外源基因能 在植物细胞中进行复制和表达。
根癌农杆菌和发根农杆菌的寄主范围很广，目前已知有90多科、 600余种植物可以感染。如烟草、大豆、棉花、马铃薯、油菜、花生、 番茄、苹果、杨树等用农杆菌转化都先后获得成功。遗憾的是大部分 单子叶植物很少或完全不能产生激活Ti质粒Vir区基因的信号分子。为 了克服根癌农杆菌转化单子叶植物的障碍，许多研究者对感染的合适 部位和转化方法进行了探讨，并发现乙酰丁香酮和其它酚类化合物可 促进大麦、小麦等很多单子叶植物的转化。经过不懈努力，科学家用 农杆菌转化重要的单子叶植物如水稻、玉米、小麦等都取得了成功。
4.胚状体再生系统
是指经体细胞培养形成的在形态结构和功能上类
似于有性胚的结构，又称体细胞胚。
优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力
强，嵌合体少，易于培养、再生。
缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。
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5.生殖细胞受体系统
以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转
化的系统。
一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、 转化受体系统；