流式细胞术及其应用

流式细胞术及其应用
分子生物学研究中心 贾宇臣
第 一 部 分 流式细胞术的一般介绍
概念
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）
利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单 细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特 定群体加以分选的现代细胞分析技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer)
PBS漂洗
70%酒精 4度固定过夜
1000rpm 5分钟 离心
收集固定的细胞
PBS
两次
两次
漂洗
37度消化1小时
2.5μl 10μg/μl
0.5 PBS
RNase A
50μl 0.1mg/ml PI （含1%Triton)，
悬浮细胞 混匀，室温 静止5分钟 上机
过300目细胞筛
建立获取模式，获取数据
集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算 机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的 一种新型高科技仪器。
流式细胞仪特点
单细胞悬液 或生物颗粒 分析速度高 多参数 精度高
当代最先进的细 胞定量分析技术
FACSCalibur
特点：
光路调节系统固定
自动化程度高
操作简便
使用寿命长
Fluorescence Activated Cell Sorting
488 nm laser
FALS Sensor
Fluorescence detector
Charged Plates
-
+
Single cells sorted into test tubes
信号检测--散色光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射 光，可以把不同类型的细胞群加以区分
配备1-2根激光 细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析
临床型（台式机）
BD LSR
FACS Vantage DiVa
特点：
多数字化
适用用各类细胞分选
4路分选
科研型（大型机）
FACSAria
特点： 分辨率高 选配多种波长和 类型激光器 可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板） 适用于高速分选 和多色分析
科研型
流式细胞仪检测范围
细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量
细 胞 结 构
细 胞 功 能
特异性抗原 （细胞表面/胞浆/核） 细胞内细胞因子 细胞活性 酶活性 激素结合位点 细胞受体
临床研究
淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细 胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27 分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应 用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效 评价、flow-FISH法测定端粒长度
T淋巴细胞检测
淋巴细胞
T淋巴细胞
CD4+T（Th)淋巴细胞检测
CD4+
淋巴细胞
R1
CD8+Ts淋巴细胞检测
CD8+
淋巴细胞
R1
B淋巴细胞检测
B淋巴细胞
淋巴细胞
R1
NK细胞检测
NK细胞
淋巴细胞
R1
结束语
流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很 强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑 战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，我们 的宗旨是将这项高新技术灵活运用于临床、科研 等领域，报告最科学、最真实的客观数据，以服 务于全社会。
单参数直方图（Histogram）
二维等高图和密度图
Pseudo 3D Plot
3D Plot
便于数据统计
不同的细胞群 可以用不同的颜 色标记
主要表达方式
二维点图Dot Plot
光谱交叉
4 colors - simultaneous collection
FITC
PE PETR
PE-CY5
激光光源 光收集系统 液流系统 流动室 液流驱动系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 细胞分选系统
•
•
•
激光光源
单波长、高强度、高稳定性 多采用氩离子激光器或氦氖激光器
一般选配2-4根激光，488nm 、633nm
和355nm、407nmUV激光
最多检测13个荧光参数
光收集系统：滤光片
基础研究
淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造 血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分 析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多 药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达 研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌 基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细 胞研究
流式细胞仪的工作原理
• 光学系统
（PI单染分析细胞周期，同时看凋亡）
去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用
数据分析
圈门去除细胞碎片 分析细胞凋亡
圈门去除粘连体， 分析细胞周期
细胞凋亡分析
Annexin V-PE/7-AAD双染色法
双阴：活细胞 双阳：晚期凋亡细胞
Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞 7-AADd单阳：坏死细胞
人外周血淋巴细胞亚群检测
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
LP 500
SP 500
BP500/50
光收集系统：光电倍增管（PMT）
FACSCalibur 光路图
液流系统：流动室、液流驱动系统
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
细胞分选系统
FSC（小角散射)光它 反应细胞的相对大小 和截面积的大小 SSC (90度角散射光) 代表细胞的颗粒度和 精细结构的变化
全血细胞流式FSC-SSC图
信号检测--荧光信号
激发态 激发 发射 激光 能量级 能量损失
特异荧光
自发荧光 特异荧光
数据显示类型
X轴：代表荧光信号或 散射光信号的强度，用 “通道数”表示，可以 与光强度之间线性关系 或对数关系 Y轴：代表该通道内所 出现具有相同光信号特 征性细胞的频率
光抗体
低表达抗原标记wenku.baidu.comS/N（信噪比）荧光素，
如PE、APC
使用双标以上抗体必做荧光补偿
流式细胞术操作流程
样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋 单细胞 悬液
标记
荧光抗体
检测
表型测定
细胞分选
统计学
分析
继续 培养
第 二 部 分 流式细胞术在不同领域的应用
细 胞 周 期 分 析
样品制备
1000rpm 5分钟 收集2X106个细胞
两色以上荧 光分析存在 光谱交叉
530 580 630 680 730 780 Emission wavelength (nm)
荧光补偿方法
所有补偿调为 “0” 调节电压，用同 型对照或阴性对照， 使阴性群位于“左 下角” 依单阳群体调节 荧光补偿
抗体使用原则
根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧