第十章_现代生物技术与环境污染治理

细胞融合：在一定条件下，将两个或多个细胞融 合为一个细胞的过程，又称细胞杂交。
细胞重组：在体外条件下，运用试验技术从活细胞中 分离出各种细胞的结构或组件，再根据需要把它们在 不同的细胞之间重新进行装配，成为具有生物活性的 细胞。
遗传物质转移：基因在细胞水平上的转移。
3.2 细胞融合构建环境工程菌
三、使用生物添加剂工程实例
对生活污水的生物处理
对印染废水的生物处理
第五节 发酵工程在环境污染治理 中的应用
5.1 发酵的基本概念
一、发酵（Fermentation）
在微生物的产能代谢中，发酵指微生物细胞将有 机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧 化的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不 同的代谢产物。 在发酵条件下，有机物只是部分被氧化，故发酵 的结果只是积累某些有机物，产生多种多样的发 酵产品。
三、固定化技术处理废水
固定化技术处理废水的优点 处理效能高，成本低，稳定性高； 可通过再培养恢复酶的相对活力。 固定化技术处理废水目前存在的问题
载体成本较高；
固定化材料对传质过程有阻碍，使酶活性大多低 于游离细胞。
工程实例
用海藻酸钙包埋固定热带假丝酵母菌处理 含酚废水 运用多孔陶珠固定具脱色功能的混合菌细 胞处理印染废水
六、对目的基因的筛选和检测 将目的基因在入载体，导入受体细胞后，必须对目的基 因进行检测，确认细胞中以摄入重组的DNA分子。检测 方法一般有遗传学方法、原位杂交法和免疫学方法。 七、目的基因在受体细胞中的表达
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目的基因在受体细胞中的表达，受到许多因素的表达。
目的基因的阅读框架必须与载体DNA的启示密码相吻 合。 要有适当的启动子保证目的基因的正确转录。 基因的蛋白产物有时还需要经过修饰和加工才能成为 有活性的功能蛋白。
2.2、基因工程的基本过程
一、基因工程的工具酶
要进行基因片段的剪切和拼接，首先需要能在特定 位置上切割DNA分子的限制性内切酶核能将DNA片段连 接在一起的DNA连接酶。 每种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在其中 特定的切点上切割DNA分子，把两种来源不同的DNA用 同一种限制酶来切，然后让两者的末端粘起来，在用 DNA连接酶将其连接起来，就可以组成重组DNA分子
一、固定化细胞的特点
固定化细胞比游离细胞稳定性高，催化效率高于 离体酶；
比固定化酶操作简便，成本低廉；
能完成多步酶反应，反应时无需补加辅助因子； 但固定化细胞内含有庞大而复杂的酶系，其中有 些酶是不需要的，甚至对反应是有害的，这是其 不足之处。
四、可逆可溶性固定化酶
酶在可溶状态下反应，反应后经简单操作可沉淀， 回收利用。
二、基因工程载体 要将一个外源的基因送入受体细胞，需要有运输工 具，这就是载体。 常用载体有：质粒，噬菌体，动植物病毒。 质粒是基因工程最常用的载体，首先由于其上有某 一限制酶的单一切点，用同种酶切断的外源DNA片段 插入该质粒的切口，就组成了重组DNA分子。其次由 于质粒上有选择性标记，可以根据受体细胞是否具有 该种标记来判断受体细胞是否获得了该重组质粒。因 此质粒在基因工程中得以广泛应用。
一、原生质体的制备与融合方法
1.概念：原生质体（Protoplast）
细胞质壁分离后去掉细胞壁所余下的那部分结构 称为原生质体。 原生质体具有原有细胞全部的内部结构与生理性 能，但无细胞壁，细胞呈球形，对渗透压敏感， 对外界理化因子比较敏感。
在外界理化融合因子的诱导下，不同物种间的 原生质体的质膜相互融合杂交，并在适当的条件 下，融合的原生质体再生出细胞壁并恢复原来完 整的细胞形态与群落形态，构成具有多种遗传性 状的新物种。故可利用原生质体融合来构建新物 种。
四、目的基因与载体的重组工艺 用同一种限制酶切割含有目的基因的外源DNA和载 DNA,产生相同的粘性末端，在DNA连接酶的作用下，形 成完整的重组DNA分子。 五、将目的基因导入受体
在体外完成的DNA的重组后，一般将重组的DNA分子 导入受体细胞让目的基因在受体细胞中表达。基因工 程中常用的受体细胞是大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌 和动植物细胞。
固定化藻细胞
3.4 废水进化生物强化技术
一、废水净化生物强化技术概述
生物强化技术（Bioaugmentation）或生物增强技 术就是为了提高处理系统的处理能力，而向该系统 中投加从自然界中筛选的优势种群并通过基因组合 技术产生的高效菌种，以去除某一种或某一类有害 物质，促进系统内生物处理效率的方法。
第四节 酶学工程与环境污染生物 治理
4.1 酶学工程基本概念与研究现状
酶工程（Enzymatic Engineering）
指利用生物有机体内酶所具有的特异催化功能， 借助固定化生物反应器和生物传感器等技术、装 置，高效优质地生产特定产品的技术。 目前酶工程主要研究酶的生产、纯化和固定化技 术以及在环境污染治理、工业、医药、卫生和理 论探索等方面的应用。
第二节 基因工程与环境污染生物 治理
2.1、基因工程分子生物学基础
遗传物质分子——脱氧核糖核酸DNA
DNA是由大量的脱氧核糖核苷酸组成的生物大分子。可 变部分是其碱基序列，嘌呤和嘧啶碱基携带遗传信息, 糖和磷酸基则起结构作用。（四种碱基：腺嘌呤A、鸟 嘌呤G、胸腺嘧啶T、胞嘧啶C）
基因
基因是DNA分子上的一个特定的片段，不同基因的遗传 信息有各自片段的碱基排列顺序所决定。 基因通过转录出的信息是核糖核酸指导mRNA合成特定的 蛋白质，使基因的以表达，完成特定的生命活动。
2.3基因工程在环境生物处理中的应用
应用基因工程菌处理污染物的主要优势：
集中与创造与目的基因，提供综合性代谢新污染的通 路和杂种细胞。 提高代谢通路结构基因的表达，针对新的污染物，改 变表达的调节方式。 控制降解途径的限制性步骤，提高分解代谢酶的合成 或其他生化反应过程效率 防止有毒中污染物的产生，防止非需要产品的出现， 用确定的基因实现最初的目的。
化学诱导法：在得到两亲本原生质体后，等量
混合两亲本的原生质体，加入适量的PEG（聚 乙二醇）和钙离子溶液，保温后，洗去多余的 PEG，在选择培养基上筛选出融合子。
电融合法：借助电场的作用，引发细胞融合。
二、原生质体融合来构建环境工程菌
原生质体融合构建苯环化合物降解菌
原生质体融合构建纤维素降解菌 聚已二醇诱导原生质体融合制备细菌杀虫剂 电融合诱导选育利用木糖和纤维二糖产乙醇 的菌株。
基因工程：核酸的分离、提取、体外剪切、拼接重组 以及扩增与表达等技术。
生 物 技 术
细胞工程：细胞的离体培养、繁殖、再生、融合，细 胞核、质、器的移植改建。
酶工程：利用酶的特异催化功能，借助固定化，生物 反应器等新技术生产特定产品的技术
发酵工程：为微生物提供最适宜的发酵条件，生产特 定产品的技术
生物技术的依据和出发点：
4.2 固定化酶
一、固定化酶及其特点
固定化酶（Immobilized Enzyme） 又称水不溶酶，是通过物理吸附法或化学键合法将水溶 性酶和固态的不溶性载体相结合，使酶变成不溶于水 但仍保持催化活性的衍生物。 固定化酶的特点： • 比较稳定，可长时间保持酶的活性； • 可回收、再生、重复使用，适合于连续化、自 动化和管道化工艺；
第十章 现代生物技术与环境污染 治理
现代生物技术概况
基因工程与环境污染治理
细胞工程与环境污染治理
酶学工程与环境污染治理
发酵工程与环境污染治理
生态工程与污水处理系统
第一节 现代生物技术的概述
1.1、现代生物技术概述
一、生物技术
生物技术（Biotechnology）是指利用生物有机体或组成部分 发展新产品或新工艺的一种技术体系。
通过改变pH、温度等理化参数，或由金属离子的 添加、去除等方法可获得可溶、不溶两种状态的 天然及合成高分子物质，将酶共价键合于这些物 质中即可产生可逆可溶性固定化酶。
二、细胞的固定化方法
自溶酶灭菌法：使细胞自溶酶失活，细胞及 可重复使用。往往使细胞中其它酶系和自溶 酶一起失活而不能广泛应用。 絮凝吸附法：加入絮凝剂，被絮凝后的细胞 再经冷冻或干燥处理后，可提高酶活性的稳 定性和改善细胞壁的机械性能，是固定化细 胞可以反复使用。
普遍存在理论
投菌法理论
二、生物活液（Living Liquor Microorganism）
生物活液：含有经过筛选的天然菌种或人工培植的 变异菌种的生物制剂。
生物活液的组成：芽孢杆菌、假单胞菌、亚硝化单 胞菌、硝化杆菌、纤维单胞菌、气杆菌、红色假单 胞菌。（以美国GES公司的LLMO为例） 使用方法：将生物活液投在进厂的截流干管或进水 井内。投加量根据进水水质并经过试验来确定。
生物在生长、发育与繁殖过程中进行物质合成、 降解和转化的能力。 生物技术的核心基础是基因工程和细胞工程。
优越性：
不可取代 快速、精确 低耗、高效 副产物、副作用小 安全性好
二、现代生物技术的发展

目前发达国家中经营石油，化工，医药，
酿造和种子等产业的公司无一例外地都竞相 开展生物技术的研究和发展生物技术产业。
2.原生质体融合方法
亲本的选择：选择两种合适于充足的亲本菌株，选 定适宜的遗传标记。
原生质体的制备：选用合适的酶系，在等渗溶 液中溶解细胞壁。 原生质体的再生：酶解后得到的原生质体能够 在等渗的培养基中重建细胞壁，恢复细胞完整形 态，并能生长、分裂的过程称为再生。 原生质体的融合与融合子的检出：
主要应用：
降解卤代芳烃的基因工程菌 分解尼龙寡聚物的基因工程菌 分解多糖的基因工程菌 抗金属基因工程菌 除草剂降解基因工程菌 杀虫剂降解基因工程菌
第三节 细胞工程与环境污染生物 处理
3.1 细胞工程概述
细胞工程 细胞工程是利用细胞学技术，有计划地改造细胞 遗传结构，从而培育出人们所需要的生物品种或 具有某些新性状的细胞群体。 细胞工程的内容 细胞培养：即使细胞在继续体外生长和繁殖。

我国生物技术目前发展的重点：为进一步
发展农业培育高产优质和抗逆的动植物新品 种：为防治严重疾病研制新型疫苗和药物： 为医药、食品化工和农业生产开辟新途径开 发蛋白质工程技术。
1.2、现代生物技术在环境科学中的应用 前景
环境生物技术
就是应用于认识和解决环境问题过程的生物技术 体系、包括对环境污染效应的认识、环境质量评价和 环境污染的生物处理技术等。 生物技术最早应用于环境污染治理的是利用农业废物 沤制堆肥。 废水生物处理主要方法——活性污泥法已经过80余年 的历程。
三、目的基因的分离
1、从基因组直接分离目的基因
常用鸟枪法，用限制酶将某种生物的DNA切成片段并分 别加入载体，对受体细胞进行转化，让外源DNA所有的片 段都在宿主细胞中大量扩增，在筛选出有目的基因的转 化细胞。该法有一定的盲目性，工作量大。
2、酶促合成法
将真核细胞基因转录的全部RNA提取出来，在体外经反 转录酶的作用，生成与mRNA互补的DNA，即cDNA，再将 cDNA酶切后载入载体，建立cDNA文库，筛选出目的基因。 或对已知核苷酸顺序的目的基因，通过聚合酶链反应 （PCR）技术直接合成。
• 可制成酶布、酶片、酶柱等多种形式。
二、酶的分离提纯
根据需要筛选产酶量高并已于培养和分离提取的优 良菌株。 按照微生物生长和生产的最适条件进行培养，即发 酵过程。 用盐析、等电电沉淀等方法对发酵液提纯。 将酶制品浓缩、结晶，并在低温下保存。
三、酶固定化方法
载体结合法 包括共价结合法、离子结合法、物理吸附法、 生物特异结合法四种。 常用载体有：活性炭、多孔玻珠、高岭土、氧 化铝等 交联法 利用戊二醛等交联剂使酶与酶发生交联而进行 固定。
包埋法
将酶包裹在凝胶格子或由半透明膜组成的胶囊 中。
逆胶束酶法
逆胶束指表面活性剂等两性分子在有机溶剂中 自发形成的聚集体。 逆胶束酶法指将酶以逆胶束的形式固定。 复合法
五、固定化酶反应器
批量反应器 装备简单、不能进行连续反应。 连续反应器 能进行连续进、出废水，效率高。
4.3 固定化细胞