核酸的分离纯化精品PPT课件
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粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。
作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。
使用注意：
1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。
2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿，180℃ 6 h。
4）剧毒。
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2.分离提取核酸的主要步骤
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2.3.3 核酸沉淀的温度和时间
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀， 影响以后的实验。一般使用0℃冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求。
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2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、 琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度 相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力， 使氢键破坏，核蛋白解聚；
2.2.2 加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还 具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
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2. 2.3 酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果， 并对核酸酶有抑制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减 少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色 素和蔗糖的作用。
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行DNA 沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。
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（4）精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。
原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝
缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质 杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为 防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一 定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇=25：24：1）。
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使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉 红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如 醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验， 因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时 应戴手套。
的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物 大分子结合的方式。
1.1.2 分离核酸原则： 1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
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1.2 防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链 中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。
所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓 冲液中需加核酸酶抑制剂。
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1.2.1 DNA酶抑制剂
(1） 金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因
此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； (2） 阴离于型表面活性剂：
盐
MgCl2 NaAc KAc NH4Ac NaCl LiCl
贮存液浓度（mol/L)
1 3 (pH5.2) 3 (pH5.2)
10 5 8
终浓度(mol/L)
0.01 0.3 0.3 2.5 0.2 0.8
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2.3.2 有机沉淀剂
（1）乙醇
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易
挥发除去，不影响以后实验。 缺点：
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
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1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.1.1 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸
I.材料准备
破碎细胞Βιβλιοθήκη II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
返回
2.1 细胞的破碎
(1)玻璃匀浆器匀浆
(2)液氮研磨法
富含DNA酶的胰、脾、胸腺、淋巴； 富含胶原蛋白的皮肤、肌腱； 坚硬的组织如骨骼。
返回
(3)高速组织捣碎机捣碎 (4)超声波处理法
核酸的分离纯化
主要内容
前言 1 核酸分离、纯化原则 1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.2. 防止核酸的生物降解 2 分离提取核酸的主要步骤 2.1 细胞的破碎 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 2.3 核酸的沉淀 2.4 核酸的浓度测定 2.5 核酸的保存 3 核酸分离纯化实例 3.1 DNA纯化实例 3.2 RNA纯化实例
返回
2.3 核酸的沉淀
• 重新调整核酸的浓度，起到浓缩核酸的作用； • 去除溶液中某些盐离子与杂质； • 改变核酸的溶解缓冲液。
DNA纯化柱
核酸提取（离心柱型） 利用硅胶膜特异吸附核酸
返回
2.3.1 核酸沉淀的盐类及浓度
当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子 状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中 不溶解，也不会被有机溶剂变性。
(5)化学处理法(SDS、吐温80等） (6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
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2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白 的结合)、氢键和非极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避 免核酸降解。
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2.2.1 加入浓盐溶液（如NaCl）
需要量大，一般要求低温操作。
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（2）异丙醇
优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用75％乙醇漂洗数次。
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（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还 能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
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1.2.2 RNA酶（RNAase)抑制剂
RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐 高温、耐酸碱、不易失活，生物降解是 RNA提取过程中的主要危害因素。
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DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)
作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。
使用注意：
1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。
2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿，180℃ 6 h。
4）剧毒。
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2.分离提取核酸的主要步骤
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2.3.3 核酸沉淀的温度和时间
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀， 影响以后的实验。一般使用0℃冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求。
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2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、 琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度 相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力， 使氢键破坏，核蛋白解聚；
2.2.2 加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还 具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
返回
2. 2.3 酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果， 并对核酸酶有抑制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减 少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色 素和蔗糖的作用。
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行DNA 沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。
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（4）精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。
原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝
缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质 杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为 防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一 定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇=25：24：1）。
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使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉 红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如 醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验， 因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时 应戴手套。
的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物 大分子结合的方式。
1.1.2 分离核酸原则： 1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
返回
1.2 防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链 中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。
所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓 冲液中需加核酸酶抑制剂。
返回
1.2.1 DNA酶抑制剂
(1） 金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因
此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； (2） 阴离于型表面活性剂：
盐
MgCl2 NaAc KAc NH4Ac NaCl LiCl
贮存液浓度（mol/L)
1 3 (pH5.2) 3 (pH5.2)
10 5 8
终浓度(mol/L)
0.01 0.3 0.3 2.5 0.2 0.8
返回
2.3.2 有机沉淀剂
（1）乙醇
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易
挥发除去，不影响以后实验。 缺点：
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
返回
1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.1.1 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸
I.材料准备
破碎细胞Βιβλιοθήκη II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
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2.1 细胞的破碎
(1)玻璃匀浆器匀浆
(2)液氮研磨法
富含DNA酶的胰、脾、胸腺、淋巴； 富含胶原蛋白的皮肤、肌腱； 坚硬的组织如骨骼。
返回
(3)高速组织捣碎机捣碎 (4)超声波处理法
核酸的分离纯化
主要内容
前言 1 核酸分离、纯化原则 1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.2. 防止核酸的生物降解 2 分离提取核酸的主要步骤 2.1 细胞的破碎 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 2.3 核酸的沉淀 2.4 核酸的浓度测定 2.5 核酸的保存 3 核酸分离纯化实例 3.1 DNA纯化实例 3.2 RNA纯化实例
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2.3 核酸的沉淀
• 重新调整核酸的浓度，起到浓缩核酸的作用； • 去除溶液中某些盐离子与杂质； • 改变核酸的溶解缓冲液。
DNA纯化柱
核酸提取（离心柱型） 利用硅胶膜特异吸附核酸
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2.3.1 核酸沉淀的盐类及浓度
当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子 状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中 不溶解，也不会被有机溶剂变性。
(5)化学处理法(SDS、吐温80等） (6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
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2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白 的结合)、氢键和非极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避 免核酸降解。
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2.2.1 加入浓盐溶液（如NaCl）
需要量大，一般要求低温操作。
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（2）异丙醇
优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用75％乙醇漂洗数次。
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（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还 能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
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1.2.2 RNA酶（RNAase)抑制剂
RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐 高温、耐酸碱、不易失活，生物降解是 RNA提取过程中的主要危害因素。
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DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)