生命科学概论结课论文

基因克隆技术综述
摘要：综述了基因克隆技术的发展历史、常用技术及最新进展，简述了各种技术的优缺点，展望了未来基因克隆技术的发展前景。

关键词：基因克隆；基因克隆技术；目的基因提取；展望
基因克隆技术是一种可以在短时间内大量复制特定基因的技术，它不仅对了解人类疾病发生发展的机制，进而探讨疾病的防治方法、手段、改善生命质量有重要价值，而且还可以用来兴旺生命科学工业(如制药业等),改良农作物、畜禽品种等，因此对现有基因克隆技术进行系统的研究和优化改进具有重要意义。

现对现有的各种技术体系，正向遗传学途径及反向遗传学途径进行综述，以把握基因克隆技术的发展历程，并对未来发展趋势进行展望。

1.相关概念
克隆是指从一个共同的祖先通过无性繁殖下来的一群遗传上相同的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊群体。

基因克隆技术又称DNA重组技术，是指在体外，通过分子生物学的方法将目的基因与运载载体重组在一起，然后引入受体细胞，使目的基因在受体细胞中得到扩增并借助受体细胞获得目的基因的表达产物——蛋白质，从而达到对目的基因的生物学特性进行研究的技术方法[1]。

一般来说，基因克隆和基因工程二者含义相近，并无大的区别，前者强调目的基因的克隆过程，而后者着重于克隆工作的全局和整体。

2.基因克隆技术研究历史回顾
基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于20世纪70年代初期。

美国斯坦福大学的伯格等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，制造了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。

1973年，科恩等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系
[2]。

3.克隆基因的常用技术
一般来讲，基因的克隆途径可分为两种：正向遗传学途径和反向遗传学途径。

前者是根据目标基因所表现的功能为基础，通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的，主要包括
功能性克隆技术和表型克隆技术；后者则着眼于基因本身，通过特定的序列或在基因组中的位置进行，包括定位克隆（图位克隆）技术、同源序列法克隆、转座子标签法克隆、基因芯片技术、表达序列标签技术（EST）和电子克隆技术等。

下面我将简单地对它们一一介绍。

3.1功能性克隆技术
功能克隆（Functional Cloning）就是从蛋白质的功能着手进行基因克隆，是人类采用的第一个克隆基因的策略。

其基本内容为：根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，分离纯化蛋白并测定出部分氨基酸序列，根据遗传密码推测其可能的编码序列，设计相应的核苷酸探针，杂交筛选cDNA文库或基因组文库，或者使用该蛋白质特异的抗体，筛选表达载体构建的cDNA文库，通过抗原抗体反应寻找特异的克隆，最后对选中的克隆测序，获得目的基因的序列[3]。

用这一策略克隆基因的关键在于必须首先分离出一个纯的蛋白，测定出其一部分氨基酸序列或得到相应抗体；其次要构建cDNA文库或基因组文库；然后要对文库进行杂交筛选。

随着生命科学研究的深入，以及蛋白质双向电泳技术和蛋白质测序技术的日趋成熟与完善，各种差异表达的蛋白质将被大量分离纯化，必将给功能克隆提供更好的条件，使之得到更加广泛的应用，功能克隆将会继续发挥其重要作用。

3.2表型基因克隆法
目前，有很多动植物，人们既不了解它们的基因产物，也没有对它们进行基因定位，但已知动植物在表现型上存在着差异，利用表现型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因就是表型克隆。

表型克隆在策略上试图将表型与基因结构或基因表达的特征联系起来，从而分离特定表型相关的基因，力求不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就直接分离该基因。

表型基因克隆法带动了许多新技术的发展，如：cDNA差式分析法（RDA）；标签接头竞争PCR技术（ATAC-PCR）；抑制消减杂交法（SSH）；基因表达连续分析法（SAGE），这些技术省去了分子标记、定位分析的连锁程序，可以分离出许多未知产物的表达基因。

3.3定位克隆
定位克隆技术（positional cloning）又叫图位克隆（map-based cloning），是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法，适合于克隆编码产物未知的基因。

其基本原理是根据功能基因在基因组中存在相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目标基因两侧紧密连锁的分子标记筛选含有大的插入片段的基因
组文库（如BAC 和YAC），用筛选到的阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群，再通过染色体步行（chromosomewalking）逐步逼近候选区域或通过染色体登陆（chro-mosome landing）的方法获得含有目标基因的大片段克隆，将含有目标基因的大片段克隆进行亚克隆，或以大片段克隆作探针筛选cDNA文库；从而将目标基因确定在一个较小的DNA 片段上并进行序列分析，通过遗传转化和功能互补试验分析，鉴定获得目的基因[4]。

利用图位克隆法克隆基因不仅需要构建完整的基因组文库,建立饱和的分子标记连锁图和完善的遗传转化体系,而且还要进行大量的测序工作,所以对基因组大标记数目不多、重复序列较多的生物采用此法不仅投资大,而且效率低。

因而图位克隆法仅局限应用在人类、拟南芥、水稻、番茄等图谱饱和生物上。

3.4同源序列法
随着人们对基因认识的不断深入,人们发现几乎所有的基因与其它的基因都有一定的联系。

人们将功能相似来自相同始祖的基因归为一个家族,基因家族的成员往往成簇存在,几个基因家族组成一个超基因家族,超基因家族各成员之间既有高度同源区域, 也有高度趋异区域, 如原癌基因(onco2gene) 、同源异型(homeotic) 基因、肌球蛋白(myosin)基因等。

人们根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特点,发展了一条快捷克隆基因家族成员的新途径———基于同源序列的侯选基因法。

其基本思路为:首先根据基因家族各成员间保守氨基酸序列设计简并引物,并用简并引物对含有目的基因的DNA 文库进行PCR 扩增,再对PCR 扩增产物进行扩增、克隆和功能鉴定。

该方法自提出以来,引起了国内外学者的广泛重视,发展很迅速,但有些问题是值得重视和思考的: ①由于密码子的简并性和不同同源序列间同源程度的差异,简并引物的特异性要设计得当。

②由于某些同源序列并不专属于某一基因家族,因而扩增产物不一定是某一基因家族成员。

③基因家族成员往往成簇存在,克隆的基因片段是否为目的基因尚需进一步判断。

因此对PCR 扩增产物和克隆产物,有必要进行基因与性状共分离分析,插入失活或遗传转化等功能鉴定工作,以便最终筛选到目的基因。

3.5转座子标签法
同源或异源的转座子或T2DNA 可以插入到基因组中导致基因结构的变化,从而产生突变基因型，人们根据这一点发展出了转座子标签法。

此法的基本程序为:首先进行突变体的诱变和鉴定工作,然后以转座子或T2DNA 作为标签DNA 制成探针或引物,筛选突变体基因组文库,用反义PCR ( IPCR) 技术分离出标签DNA 两侧目的基因部分序列,再依据序列设计探针或引物筛选野生型基因组文库,即可分离出完整的基因,最后用基因互补测验检测其功能[5]。

由于有些植物存在内源转座子,像金鱼草、玉米、拟南芥,因而利用和植物本身同源的转座子转座就不能区分真正标签基因的转座子,所以转座子标签多用异源植物。

另外大多数转座子转座频率不高,拷贝数过多,导致诱变频率很低,这使大多数植物很难获得转座子突变体,而且亲本之一必须含有转座子或要通过转基因或杂交进行转座子引入,从而限制了它的应用。

3.6基因芯片技术（DNA芯片技术）
基因芯片技术是由核酸片段如一系列用特定荧光标记的寡核苷酸探针，以预先设计排列的方式固定在载玻片或尼龙膜上组成生物集成膜片，与不同标记的游离靶分子（DNA或RNA）杂交，或生物集成膜片的不同靶分子与游离的探针杂交，然后应用荧光信号检测器及处理器根据杂交分子和未杂交分子发出不同波长的光检测杂交信号。

这些不同区域的荧光信号在芯片上组成荧光分布谱型，可被激光聚焦显微镜激发和检测，经电脑软件的处理检出DNA序列及其变化。

基因芯片具有高通量、高信息量、快速、样品用量少、造价低、用途广泛等优点。

3.7表达序列标签技术（EST）
该方法的基本过程为: ①对已知的部分序列进行数据库分析,筛选出代表新基因的EST 及相应的重叠群,定位信息等,根据所得信息设计引物,制备探针。

②用探针进行cDNA文库筛选,得cDNA阳性克隆,接着用设计引物与所得cDNA阳性克隆载体臂进行巢式PCR 和5’、3’- RACE ,得5’端和3’端部分序列(约400 bp) 。

③对所得阳性克隆和末端序列进行测序。

④通过数据库对新序列进行分析,包括与已知基因的同源性分析、拼接延伸、ORF 识别、结构分析、翻译蛋白质分析等。

⑤若第一步有新EST 的定位信息,即可对基因进行定位和结构分析;若无定位信息,还要筛选基因组文库,进行测序和FISH 定位等工作。

⑥最后对发现的新基因进行突变检测和表达分析[6]。

该方法是建立在大量已有的生物信息资源基础上的,同时结合了目前的新技术,为大规模克隆基因提供了捷径,但前提是手头要有已知的序列。

目前,国际上相当数量的基因分离是从分析同源EST开始的。

3.8电子克隆技术
电子克隆法是利用目的基因在其他生物中的同源基因对目的基因所在生物的EST 库通过序列比对进行筛选，如果能够得到相似性比较高的EST 序列，根据这些EST 序列设计引物进行PCR 或RT－PCR,就可以得到目的基因片段或全长cDNA，然后通过染色体步移或RACE 分别得到全长基因或cDNA。

电子克隆充分利用已有的生物信息资源，从ESTs序列入手、通过同源筛选，获得基因部分乃至全长cDNA序列，避免或减轻了构建与筛选cDNA
文库等繁重、耗时的实验室工作，将大大加快基因克隆的方法。

与传统的实验室克隆基因的繁杂、耗时、费用高、效率不高的方法相比，电子克隆更为简捷、快速、费用大大降低。

随着多种模式生物的基因组测序工作的完成，以及各种生物的EST数据库的建立和充实，电子克隆必将在基因克隆的领域占有重要的一席之地，也必将加快新基因的发现与克隆的进程。

4.总结与展望
基因克隆的技术发展很快,种类也越来越多,但每一种方法都有它的优势和劣势及适用范围和限制因素。

综合来看,不同的克隆策略,虽主导思路不同,但常常是相互联系相互补充的, 有些过程也是共通的,因而实验者必须根据所克隆基因的类型和实际条件选择最佳的方案。

生物的基因是一片海洋，在基因克隆的领域，人类已经迈出了坚实的步伐，但要彻底破译生命的天书，基因克隆的研究仍任重而道远，基因克隆的进展依赖于基因克隆技术的发展与创新。

展望未来，基因克隆技术的发展将可能有以下趋势：
○1高通量，高效率，经济快速的基因克隆技术将会领导潮流，如SSH、基因芯片等。

生命科学的发展一日千里，效率低下、耗时耗力的克隆技术必将退出舞台。

○2在基因克隆中，计算机技术、电子技术将扮演更加重要的角色。

基因组测序，基因芯片，电子克隆等技术的产生与发展，都与计算机技术的发展息息相关。

面对日益增多的生物信息的海洋，没有计算机技术和电子技术的辅助，人类只能望洋兴叹。

○3不同的基因克隆技术之间的相互交叉融合。

例如抑制消减杂交与基因芯片技术相结合，电子克隆与RT-PCR相结合等，将显示出巨大的应用前景。

○4模式生物基因组计划的完成和相关数据库的建成为我们利用生物信息学方法克隆新基因带来了新的机遇，充分利用网上的生物信息资源，灵活运用基于EST 和基因组数据库的基因克隆策略，成为不可忽视的捷径。

总之，随着各种知识的积累,克隆基因的技术也逐步完善,速度效率也不断提高,相信人类终将掌握大规模、快捷、经济基因克隆的技术,并很快将基因的研究安全地应用到实践中去。

参考文献
[1] 王廷华，董坚，齐建国等.基因克隆理论与技术[M].北京.科学出版社，2009: 1-3.
[2] Cohen, S.N. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro [J].
Biotechnology，1992，24.
[3] 刘新伟，朱文豪，李何. 基因克隆技术研究进展[J]. 河南职工医学院学报,
2010.6:753-756
[4] 李敏, 李焕秀，李靖. 植物基因克隆技术研究进展[J]. 生命科学研究,2004,8(2):116-119.
[5] 周国岭, 杨光圣, 傅廷栋. 基因克隆技术[J]. 华中农业大学学报,2001,20(6):584-590.
[6] 秦春圃. 国内信息-五种基因克隆技术[J]. 生物技术通报,2002,6:46-49.。