沉淀法

（五）聚电解质沉淀法
一些聚电解质物质如离子型的多糖化合物、阳离子 聚合物和阴离子聚合物，可以用来沉淀蛋白质物质，其 作用方式与絮凝剂类似，同时还兼有一定的盐析和简单 水化的作用。
1.原理
两性电解质在等电点时溶解度最低
precipitation)
不同的两性电解质具有不同的等电点
2. 优点： 1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内
2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低
3. 缺点： 酸化时，容易引起蛋白质失活
（三） 有机溶剂沉淀法（降低介电常数）
利用蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分 离的方法。
沉淀分离
•使溶液中的溶质由液相转变为固相析出 •古老、实用、简单的初步分离方法
最常用的几种沉淀方法：
⑴盐析法（中性盐沉淀）
⑵等电点沉淀法
⑶有机溶剂沉淀法
⑷非离子型多聚物沉淀法
⑸聚电解质沉淀法
（一）盐析法（改变离子强度）
1. 盐溶和盐析
向蛋白质的水溶液中加入中性盐，可产生
两种现象： 1) 盐溶（salting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out） ： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。
1. 沉淀机理
降低溶液的介电常数
部分地引起蛋白质脱水 2. 常用有机溶剂 乙醇、丙酮、甲醇，用量一般为酶液体积的2 倍左右，终浓度为70%。
3.优缺点：
优点： 1）分辨率比盐析法高 2） 沉淀不需脱盐
3）溶剂易蒸发，沉淀易离心
缺点： 1）容易引起蛋白质变性失活
2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较
高。
（四）非离子型多聚物沉淀法
1. 作用机理： 与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。 2. 沉淀剂： 常用聚乙二醇 （Polyethyene glycol，简写 PEG 多用分子量为6000～20000的 PEG ）、单宁等 3. 优点： ①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。 ②沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当 多的生物大分子。
•
盐析法：利用不同蛋白质在不同盐浓度条 件下溶解度不同的特性，通过在蛋白质溶 液中添加一定浓度的中性盐，使蛋白质或 杂质从溶液中析出沉淀，从而使蛋白质与 杂质分离。
2. 盐析原理：
Cohn方程式：
S log Ks I S0
I：离子强度，I = 1/2∑mZ2； m：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数 S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐有关的特性常数。 Ks代表盐析效率 ，其含义是随着盐浓度的增加， 蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。
影响盐析的主要因素
• • • • 蛋白质浓度 离子强度和种类 温度 PH
蛋白质浓度
对不同蛋白 质的浓度，应使 用不同的硫酸铵 饱和度范围。
离子强度和种类
离 子 强 度 越 大， 蛋 白 质 的 溶 解 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 越 低
离子半径小并 且电荷很高的 离子，Ks越大 对盐析作用的 影响越强。
温度
PH
（二） 等电点沉淀(isoelectric
当温度一定时，S0对于某一溶质是一个 常数，即
logS0
所以上式可以改写为
logS Ks I
两种盐析法： Ks分段盐析法 ：在一定的pH和温度条件下， 通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）使 不同酶先后沉淀的方法。 β 分段盐析法 ：在一定盐和离子强度下，通 过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。