蛋白质检测方法
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2、考马斯亮蓝 G-250 在游离状态下呈红色，吸收峰位 置为 488 nm 左右，容易与蛋白质中的精氨酰和赖氨酰 残基结合，结合后颜色变为蓝色，最大吸收峰的位置 转移到 595nm。
优点：结合稳定、反应速度快、显色灵敏度高，操作 简便，不受酚类、游离氨基酸、络合剂等成分干扰
缺点：不同蛋白质中的精氨酰和赖氨酰残基的含量不 同，因此其与不同的蛋白质结合有强有弱，导致测量不 同的蛋白质时存在较大偏差
凯氏定氮法由于蛋白质是体内的主要含氮物，因此，通过测 定生物样品的含氮量便可估算出样品中的总蛋白质含量。
蛋白质含量＝含氮量 Х 6.25 此方法的测定范围为0.2～1.0 mg氮。 优点：应用范围广，重现性好、准确度高 缺点：局限于样品中总蛋白的检测，破坏蛋白质结构，
易受到被测样品中其它有机含氮化合物的干扰
比色法-BCA法
优点：稳定性好、显色灵敏度高，显色灵敏度与 Folin-酚法相当，且不受去垢剂、变性剂的影响
缺点：反应速度慢，易受糖类、尿素、B2 巯基乙醇等 物质的干扰，比Folin-酚法对糖类更加敏感
比色法-考马斯亮蓝法
理论基础：
1、考马斯亮蓝属于三苯甲烷类染料，分为 G-250 和 R250 两种，是目前使用最为广泛的一种蛋白质染色剂。
ELISA 和 Western 杂交都利用抗原抗体间的分子识别作用， 借助不同的抗体分子标记实现蛋白质的检测。
紫外吸收法
理论基础：蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色 氨酸残基使其在 280 nm 处具有紫外吸收， 其吸光度 与蛋白质含量成正比。 此外，蛋白质溶液在 238 nm 的吸光度值与肽键含量成正比。 利用一定波长下蛋白 质溶液的吸光度值与蛋白质浓度的正比关系可以测定 蛋白质含量。
其颜色深浅与蛋白质浓度在一定范围内呈线性关系，可用于
定量分析。
优点：反应灵敏，检测限低，比较适合微量蛋白质的测量 缺点：Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定因而要求精确控
制操作时间，且容易受去酚类、糖类、尿素等多种物质的干
扰。此外，而不同的蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，
导致在不知道蛋白质种类的情况下测量结果存在部分偏差。
Contents
1、蛋白质简介 2、蛋白质的检测方法 3、蛋白质与疾病的关系
蛋白质简介
蛋白质是由氨基酸脱水缩合形成的空间结构复杂的大分子有机物，其 主要化学元素为 C（约 50%）、O（约23%）、N（约16%）、H（约 7%）、S（约 0~3%）。氨基酸是蛋白质的基本组成单位，蛋白质既具有 氨基酸的部分理化特性，也具有其它有机物的一些共性以及众多的自身 独有特点与性质：
高分子、两性解离及等电点、水合作用、变性作用、显色反应（双缩 脲反应、Folin-酚反应、茚三酮反应、米伦反应、黄蛋白反应、乙醛酸反 应、坂口反应、偶氮反应、考马斯亮蓝反应、氨基酸的α-氨基及α-羧基 反应、） 蛋白质的异常表达与体内多种疾病的发生发展息息相关
蛋白质Байду номын сангаас检测方法
传统蛋白质检测方法：免疫印迹法；酶联免疫吸附试 验
比色法-双缩脲法
原理：蛋白质含有两个以上的肽键，故有双缩脲（NH2CO-NH-CO-NH2）反应。在碱性条件下，肽键的质子被解离， Cu2+和失去质子的多肽链的氮相结合产生稳定的紫色络合物， 在540～560 nm的光吸收值与蛋白质的含量在一定范围内呈 线性关系。由于与双缩脲试剂与不同种类的蛋白质反应产物 的颜色差别极小，使得该方法比较适合总蛋白质的检测。
比色法-BCA法
BCA （Bicinchoninic acid) 试剂的主要成分为二喹啉 甲酸钠。 BCA并不能直接与蛋白质发生化学或是物理上的反应， 而是对双缩脲反应的强化。BCA 极易与 Cu+结合形成紫 色的复合物，该复合物在 562 nm 处有最大吸收峰，对 入射光的吸收程度与 Cu+的浓度成正比。
优点：操作简单、测量速度快
缺点：灵敏度较差，精度不高
比色法-Folin-酚试剂/Lowry法
原理：1、蛋白质在碱性条件下与试剂甲（双缩脲试剂）中
的Cu2+形成络合物。
2、由于蛋白质含芳香族氨基酸残基（如Tyr和
Trp），生成的络合物可还原试剂乙（Folin-酚试剂）中的磷
钼酸和磷钨酸而产生钼蓝和钨蓝复合物，该复合物显蓝色，
常规方法： 物理法：紫外吸收法 化学法：凯氏定氮法；比色法 高效液相色谱法 毛细管凝胶电泳法 近红外光谱法 质谱法 荧光法
免疫印迹法（ Western blot）
原理：蛋白样品经过电泳分离后，转移并固定于膜上，然 后应用抗原抗体反应进行特异性检测的方法。 Western 杂交 是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定相结合的特异性蛋白质的 检测方法 免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白的 定性方法，也可以作为确定同一种蛋白质在不同细胞或同一 种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法。
免疫印迹法检 测样品中特异 蛋白质的基本 流程
样品的凝胶电泳 蛋白印迹 封闭反应
与特异性抗体（一抗）孵育 与酶耦联的二抗孵育 显色或化学发光显影 观察和记录结果
酶联免疫吸附试验
原理：酶联免疫吸附试验（ enzyme linked immunosorbant assay，ELISA）是一种固相免疫测定技术，先将已知的抗原 或抗体包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定 时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表 面吸附的抗原或抗体发生特异性反应。最后加入酶反应底物， 根据底物被酶催化产生的颜色及其光密度（OD）值的大小 进行定性或定量分析。 优点：灵敏度高；特异性好；简便；重复性好。
优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回 收
缺点:准确度较差、专一性差、干扰物质多，若样品中 含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出 现较大的干扰
凯氏定氮法
理论基础：
1. 各种蛋白质的含氮量很接近，通常占其总重量的16％左 右。
2. 蛋白质样品用浓硫酸消化后，可以转变为硫酸铵，硫酸 铵收后中，的可NH由4+标与准N盐aO酸H滴反定应并又定可量转。变为NH3，用硼酸液吸
优点：结合稳定、反应速度快、显色灵敏度高，操作 简便，不受酚类、游离氨基酸、络合剂等成分干扰
缺点：不同蛋白质中的精氨酰和赖氨酰残基的含量不 同，因此其与不同的蛋白质结合有强有弱，导致测量不 同的蛋白质时存在较大偏差
凯氏定氮法由于蛋白质是体内的主要含氮物，因此，通过测 定生物样品的含氮量便可估算出样品中的总蛋白质含量。
蛋白质含量＝含氮量 Х 6.25 此方法的测定范围为0.2～1.0 mg氮。 优点：应用范围广，重现性好、准确度高 缺点：局限于样品中总蛋白的检测，破坏蛋白质结构，
易受到被测样品中其它有机含氮化合物的干扰
比色法-BCA法
优点：稳定性好、显色灵敏度高，显色灵敏度与 Folin-酚法相当，且不受去垢剂、变性剂的影响
缺点：反应速度慢，易受糖类、尿素、B2 巯基乙醇等 物质的干扰，比Folin-酚法对糖类更加敏感
比色法-考马斯亮蓝法
理论基础：
1、考马斯亮蓝属于三苯甲烷类染料，分为 G-250 和 R250 两种，是目前使用最为广泛的一种蛋白质染色剂。
ELISA 和 Western 杂交都利用抗原抗体间的分子识别作用， 借助不同的抗体分子标记实现蛋白质的检测。
紫外吸收法
理论基础：蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色 氨酸残基使其在 280 nm 处具有紫外吸收， 其吸光度 与蛋白质含量成正比。 此外，蛋白质溶液在 238 nm 的吸光度值与肽键含量成正比。 利用一定波长下蛋白 质溶液的吸光度值与蛋白质浓度的正比关系可以测定 蛋白质含量。
其颜色深浅与蛋白质浓度在一定范围内呈线性关系，可用于
定量分析。
优点：反应灵敏，检测限低，比较适合微量蛋白质的测量 缺点：Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定因而要求精确控
制操作时间，且容易受去酚类、糖类、尿素等多种物质的干
扰。此外，而不同的蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，
导致在不知道蛋白质种类的情况下测量结果存在部分偏差。
Contents
1、蛋白质简介 2、蛋白质的检测方法 3、蛋白质与疾病的关系
蛋白质简介
蛋白质是由氨基酸脱水缩合形成的空间结构复杂的大分子有机物，其 主要化学元素为 C（约 50%）、O（约23%）、N（约16%）、H（约 7%）、S（约 0~3%）。氨基酸是蛋白质的基本组成单位，蛋白质既具有 氨基酸的部分理化特性，也具有其它有机物的一些共性以及众多的自身 独有特点与性质：
高分子、两性解离及等电点、水合作用、变性作用、显色反应（双缩 脲反应、Folin-酚反应、茚三酮反应、米伦反应、黄蛋白反应、乙醛酸反 应、坂口反应、偶氮反应、考马斯亮蓝反应、氨基酸的α-氨基及α-羧基 反应、） 蛋白质的异常表达与体内多种疾病的发生发展息息相关
蛋白质Байду номын сангаас检测方法
传统蛋白质检测方法：免疫印迹法；酶联免疫吸附试 验
比色法-双缩脲法
原理：蛋白质含有两个以上的肽键，故有双缩脲（NH2CO-NH-CO-NH2）反应。在碱性条件下，肽键的质子被解离， Cu2+和失去质子的多肽链的氮相结合产生稳定的紫色络合物， 在540～560 nm的光吸收值与蛋白质的含量在一定范围内呈 线性关系。由于与双缩脲试剂与不同种类的蛋白质反应产物 的颜色差别极小，使得该方法比较适合总蛋白质的检测。
比色法-BCA法
BCA （Bicinchoninic acid) 试剂的主要成分为二喹啉 甲酸钠。 BCA并不能直接与蛋白质发生化学或是物理上的反应， 而是对双缩脲反应的强化。BCA 极易与 Cu+结合形成紫 色的复合物，该复合物在 562 nm 处有最大吸收峰，对 入射光的吸收程度与 Cu+的浓度成正比。
优点：操作简单、测量速度快
缺点：灵敏度较差，精度不高
比色法-Folin-酚试剂/Lowry法
原理：1、蛋白质在碱性条件下与试剂甲（双缩脲试剂）中
的Cu2+形成络合物。
2、由于蛋白质含芳香族氨基酸残基（如Tyr和
Trp），生成的络合物可还原试剂乙（Folin-酚试剂）中的磷
钼酸和磷钨酸而产生钼蓝和钨蓝复合物，该复合物显蓝色，
常规方法： 物理法：紫外吸收法 化学法：凯氏定氮法；比色法 高效液相色谱法 毛细管凝胶电泳法 近红外光谱法 质谱法 荧光法
免疫印迹法（ Western blot）
原理：蛋白样品经过电泳分离后，转移并固定于膜上，然 后应用抗原抗体反应进行特异性检测的方法。 Western 杂交 是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定相结合的特异性蛋白质的 检测方法 免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白的 定性方法，也可以作为确定同一种蛋白质在不同细胞或同一 种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法。
免疫印迹法检 测样品中特异 蛋白质的基本 流程
样品的凝胶电泳 蛋白印迹 封闭反应
与特异性抗体（一抗）孵育 与酶耦联的二抗孵育 显色或化学发光显影 观察和记录结果
酶联免疫吸附试验
原理：酶联免疫吸附试验（ enzyme linked immunosorbant assay，ELISA）是一种固相免疫测定技术，先将已知的抗原 或抗体包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定 时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表 面吸附的抗原或抗体发生特异性反应。最后加入酶反应底物， 根据底物被酶催化产生的颜色及其光密度（OD）值的大小 进行定性或定量分析。 优点：灵敏度高；特异性好；简便；重复性好。
优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回 收
缺点:准确度较差、专一性差、干扰物质多，若样品中 含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出 现较大的干扰
凯氏定氮法
理论基础：
1. 各种蛋白质的含氮量很接近，通常占其总重量的16％左 右。
2. 蛋白质样品用浓硫酸消化后，可以转变为硫酸铵，硫酸 铵收后中，的可NH由4+标与准N盐aO酸H滴反定应并又定可量转。变为NH3，用硼酸液吸