紫外可见分光光度法的原理及应用PPT
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紫外可见分光光度计原理使用及维护.精选PPT
2、结构
1）光源（氘灯、钨灯）→2）单色器 （光栅）→3）吸收池→4）检测器→
↑样品 5）信号显示系统
三、分光光度法测定时需要考虑的因素
1、反应条件的选择
1)显色剂的用量； 2)溶液酸度； 3)溶液温度； 4)显色时间； 5)溶剂，比如有机溶剂常能降低有色化合物的分离度，从
而提高显色反应的灵敏度。
液，彻底清洗吸收池或者其他玻璃器皿。了解内容：铬酸洗液的配制方法： 20g的K2Cr2O7，溶于40mL水中,将浓H2SO4 360mL徐徐加入 K2Cr2O7溶液中。
吸收池
主要部件
c、严重的污染需要用超声波清洗。
清洗注意事项： 三、分光光度法测定时需要考虑的因素
了解内容：铬酸洗液的配制方法：20g的K2Cr2O7，溶于40mL水中,将浓H2SO4 360mL徐徐加入K2Cr2O7溶液中。 5、紫外分光光度计测样不稳定和不准确的原因 ↑样品
4、紫外可见分光光度计主要部件介绍
坏！ 7)、利用导数光谱法、双波长等新技术。
2）、不能用带易掉毛的工具(如劣质纸、劣质棉花等) 擦拭比 色皿的受光面，不要用洗洁精之类的清洁剂。以免影响测量。
检测器
主要部件
检测器的作用是检测光信号，并将光信号 转变为电信号。现今使用的分光光度计大 多采用光电管或光电倍增管作为检测器。
吸收池
主要部件
吸收池材质：吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分
为玻璃吸收池和石英吸收池。
切记：玻璃比色皿不能用于紫外区！
区分方法:可用仪器实测紫外区200nm波长处的吸光
度值。
主要部件
吸收池 因比色皿的使用不当易导致数据重复性差。 原因：角度、位置变化、表面洁净度、污染程度 注意：粘接的比色皿不适合装浓硫酸、不适合用高 于25瓦的超声波机清洗。
紫外可见分光光度计原理及操作.ppt
吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或
测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。 3）紫外分光光度法使用基于朗伯-比耳定律(Lambert－Beer)。
朗伯-比耳定律是光吸收的基本定律，俗称光吸收定律，是分光光度法
定量分析的依据和基础。
朗伯-比耳定律
一、透射率T%
dT d lg T 0.434 bdc T
将上两式相比，并将 dT 和 dc 分别换为T 和 c，得
c 0.434T c T lg T
当相对误差 c/c 最小时，求得T=0.368 或 A=0.434。即当A=0.434 时，吸光度读数误差最小！ 通常可通过调节溶液浓度或改变光程 b来控制A的读数在0.15~1.00范类型来自3.比例双光束分光光度计
由同一单色器发出的光被分成两束，一束直接到达检测器，另一束 通过样品后到达另一个检测器。这种仪器的优点是可以监测光源变化带
来的误差，但是并不能消除参比造成的影响
UV-2550的特点
6 挡狭缝可选
PC 控制存储、调用方便 可采用复制、拷贝方法在电子表格和字处理软件中处理数据和打印报 告 可加载膜厚、动力学、多波长、色彩分析等软件 DDM（双闪耀波长双单色器）降低杂散光，提高长波长区的能量响应 （UV-2550）
它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。现在一般的紫
外可见分光光度计有计算机控制和主机单片机控制两种类型，功能基本 类似。
类型
紫外-可见分光光度计的类型很多，但可归纳为三种类 型，即单光束分光光度计、双光束分光光度计和比例双光束 分光光度计。
1.单光束分光光度计 经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以 进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，维修 容易，适用于常规分析。
紫外-可见分光光度法 PPT课件
若化合物在某波长处有强的吸收峰，而所含杂质在该波长处 无吸收或吸收很弱，则化合物的吸光系数将降低，若杂质在
该波长有比此化合物更强的吸收，将会使化合物的吸光系数
增大，且会使化合物的吸收光谱变形。（举一个间接的例子
吧，前一段时间快检车抽到一批吗叮啉，红外快检认定是假
药，送到所里以后，我们用薄层法做了一下，发现样品也显
百分吸收系数 377
吸收度值 277nm 0.461
0.461×0.2609×100.00×200.00
含量=-----------------------------------×100%=96.97%
377×0.0658×5.00×0.2×100
二、多组分定量测定 解线性方程组法 等吸收双波长消去法 系数倍率法 导数光谱法
面神经麻痹的病理变化早期主要为面神经水肿髓鞘和轴突有不同程度的变性以在茎乳突孔和面神经管内的部分尤为显著w五测定时除另有规定外应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照测定吸光度实际上是透光率而在测定光强弱时不只是由于被测物质的吸收所致还有溶剂和容器的吸收光的色散和界面反射等因素都可使透射光减弱用空白对照可排除这些因素的干扰
由上图可以看出吸收光谱的特征： ⑴曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称 最大吸收波长，以λmax表示。 ⑵曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，所对应的波 长，称最小吸收波长，以λmin 表示。 ⑶曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，形状像 肩的部位，称肩峰，以λsh表示。
⑷在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处， 吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。
利用物质的吸收光谱进行定量、定性及结构 分析的方法称为吸收光谱分析法。紫外－可 见吸收光谱是一种分子吸收光谱，它是由于 分子中原子的外层电子跃迁而产生的。
紫外分光光度计的使用原理和方法 PPT
这些显色反应,必须满足以下条件:
1、反应得生成物必须在紫外-可见光区有较 强得吸光能力,即摩尔吸光系数较大;
2、反应有较高得选择性,即被测组分生成得 化合物吸收曲线应与共存物质得吸收光谱有 明显得差别;
3、 反应生成得产物有足够得稳定性,以保 证测量过程中溶液得吸光度不变;
4、反应生成物得组成恒定。
按所吸收光得波长区域不同,分为紫外分 光光度法与可见分光光度法,合称为紫外-可见 分光光度法。
紫外-可见分光光度法得特点:
1 与其它光谱分析方法相比,其仪器设备与操 作都比较简单,费用少,分析速度快;
2 灵敏度高; 3 选择性好; 4 精密度与准确度较高; 5 用途广泛。
§1、 紫外-可见吸收光谱
3、 狭缝宽度得选择
为了选择合适得狭缝宽度,应以减少狭 缝宽度时试样得吸光度不再增加为准。一 般来说,狭缝宽度大约就是试样吸收峰半 宽度得十分之一。
二、显色反应条件得选择
对多种物质进行测定,常利用显色反应 将被测组分转变为在一定波长范围有吸收 得物质。常见得显色反应有配位反应、氧 化还原反应等。
参比溶液得选择视分析体系而定,具体有:
1、溶剂参比 试样简单、共存其它成分 对测定波长吸收弱,只考虑消除溶剂与吸收 池等因素;
2、试样参比 如果试样基体溶液在测定 波长有吸收,而显色剂不与试样基体显色 时,可按与显色反应相同得条件处理试样, 只就是不加入显色剂。
3、试剂参比 如果显色剂或其它试剂在 测定波长有吸收,按显色反应相同得条件, 不加入试样,同样加入试剂与溶剂作为参 比溶液。
红移与紫移
在有机化合物中,常常因取代基得变更或 溶剂得改变,使其吸收带得最大吸收波长λmax 发生移动。向长波方向移动称为红移(表3-3), 向短波方向移动称为紫移。
紫外可见分光光度PPT(完整版)课件
因此，可能的跃迁为σ → σ*、π→ π*、n→ σ* n→ π*等。
2023/10/14
10
Wavelength
2023/10/14
11
て
~104 10～100 100～300
k
~200 200～800
<200 ~150(<200)
Amax(nm)
<U<M<M<xD<U<*0<1<*1<0<*0<0
(red shift 或bathochromic
shift) 指取代基或溶剂效应引起吸收带 向长波方向的移动；
蓝移 ( blue shift 或 hypsochron sh ift) 或紫移： 吸收带向短
波方向移动
2023/10/14
16
常见助色团及其助色效应(红移)λ
-F<-Cl<-Br<-OH<-OCH₃<-N NHCH₃<-N(CH₃)₂<-NHC₆H₅<
6
分子中电子能级、振动能级和转动能级示意图
2023/10/14
不是任一波长的 光都可以被某一物质 所吸收，由于不同物 质的分子其组成结构 不同，它们所具有的 特征能级也不同，故 能级差不同，而各物 质只能吸收与它们内 部能级差相当的光辐 射，所以，不同物质 对不同波长的光吸收 具有选择性。
7
物质颜色与光吸收的关系
2023/10/14
29
四、 无机化合物的吸收光谱
金属离子 金属离子
配位体
d-d配位场跃迁
配位体
配位体π- π*
金属离子
配位体
电荷转移
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Wavelength
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11
て
~104 10～100 100～300
k
~200 200～800
<200 ~150(<200)
Amax(nm)
<U<M<M<xD<U<*0<1<*1<0<*0<0
(red shift 或bathochromic
shift) 指取代基或溶剂效应引起吸收带 向长波方向的移动；
蓝移 ( blue shift 或 hypsochron sh ift) 或紫移： 吸收带向短
波方向移动
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16
常见助色团及其助色效应(红移)λ
-F<-Cl<-Br<-OH<-OCH₃<-N NHCH₃<-N(CH₃)₂<-NHC₆H₅<
6
分子中电子能级、振动能级和转动能级示意图
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不是任一波长的 光都可以被某一物质 所吸收，由于不同物 质的分子其组成结构 不同，它们所具有的 特征能级也不同，故 能级差不同，而各物 质只能吸收与它们内 部能级差相当的光辐 射，所以，不同物质 对不同波长的光吸收 具有选择性。
7
物质颜色与光吸收的关系
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四、 无机化合物的吸收光谱
金属离子 金属离子
配位体
d-d配位场跃迁
配位体
配位体π- π*
金属离子
配位体
电荷转移
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常见有机化合物的紫外可见吸收光谱ppt课件
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
溶液的颜色与光吸收的关系
完全吸收
光谱示意 复合光 表观现象示意
完全透过
吸收黄色光
物质呈现颜色与吸收光波长的关系见下表。
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
第一节 基本原理
一、光的基本特性 1.光的波动性 光是一种电磁波，电磁波可以用周期T(s)、
频率( עHz)、波长λ(nm)和波数σ（cm-1） 等参数描述。它们之间的关系为： =1/T=c/λע /cעσ=1/λ=
互作用。
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
4.偏离朗伯一比尔定律的原因
定量分析时，通常液层 厚度是相同的，按照比尔 定律，浓度与吸光度之间 的关系应该是一条通过直 角坐标原点的直线。但在 实际工作中，往往会偏离 线性而发生弯曲。
透光度T （透射比）Transmittance
定义透光度：
T It I0
T 取值为0.0 ~ 1.0 全部吸收 ~~~~ 全部透射
吸光度A (Absorbance）
定义吸光度 ：
A 取值为 0.0 ~∞
二者关系为：
A lg I 0 It
全部透射~~~全部吸收
A = lg(1/T) = -lgT
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中某些特定波长的光线选择吸收的结果。
紫外-可见分光光度法的原理
物质的结构决定了物质在吸收光时只能吸收某些特定波 长的光。我们可以利用测量物质对某种波长的光的吸收来了 解物质的结构特性。
用经过分光后的不同波长的光依次透过该物质，通过测 量物质对不同波长的光的吸收程度（吸光度），以波长为横 坐标，吸光度为纵坐标作图，就可以得到该物质在测量波长 范围内的吸收曲线。这种曲线体现了物质对不同波长的光的 吸收能力，称为吸收光谱。
吸收光谱
透射光 检测器
入射光 不同波长光
紫外-可见分光光度法的原理-定性分析
紫外-可见分光光度法是利用物质对光的吸收光谱，对 物质进行定性分析或定量分析的方法。按所吸收光的波长 区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称 为紫外-可见分光光度法。
不同结构的物质吸收光谱也不同，这是对物质进行定性 分析的基础：通过检测吸收光谱来比对鉴定分析物质。
缺点： ⑴仅适合微量分析； ⑵所需仪器相对昂贵。
应用
1
2
1.定性分析 各种物质具有各自不 同的分子、原子和不 同的分子空间结构， 其吸收光能量的情况 也就不会相同，因此， 每种物质就有其特有 的、固定的吸收光谱 曲线
纯度的鉴定
用紫外吸收光谱 确定试样的纯度是比 较方便的。如果一化 合物在紫外区没有吸 收峰，而其杂质有较 强吸收，就可方便的 检出该化合物中的痕 量杂质。
可见光光源，如钨灯和卤钨灯；紫外光源，如氢 灯和氘灯。
根据测定时所选用的光源： ➢可见分光光度法(400800nm) ➢紫外分光光度法(200400 nm)➢红外分光光度法(800nm50m)
氙灯
氢灯
钨灯
2 单色器 单色器以棱镜或光栅分光，提供单色光。
白光 入射狭缝 准直透镜
λ1
棱镜
λ2
聚焦透镜 出射狭缝
标准曲线法(工作曲线法)
⑴测定步骤 ①首先配制一系列被测物的标准溶液，测其
吸光度，绘出A-c工作曲线； ②在相同条件下，测出被测物的吸光度Ax; ③根据Ax的值在工作曲线上查处cx的大小。
⑵适用范围 大批重复试样的分析。
未知物的 吸光度
未知物 的浓度
紫外可见分光光度法的定量方法
单一组分的测定 （1）标准对照法
3
结构分析 紫外-可见吸收
光谱一般不用于化合 物的结构分析，但利 用紫外吸收光谱鉴定 化合物中的共轭结构 和芳环结构还是有一 定价值。
成正比.
L
入射光 I0
透射光 It
C
吸收系数
吸光系数
❖ 1．定义
❖ 一定条件下，吸光物质在单位浓度及单位 液层厚度时的吸光度，叫这个物质的吸光系数。
❖ 2．两种表示方法
❖ (1) 摩尔吸光系数(ε )：一定波长下，吸光 物质的溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时， 溶液的吸光度。
❖ (2)百分吸光系数(ελ)：一定波长下，吸光 物质的溶液浓度为1g/100ml(1%)，液层厚度为 1cm时，溶液的吸光度。
吸 光 度
波长范围
利用标准物质定性分析
在相同条件下，测定未知物 的吸收光谱，与标准物的吸收光 谱进行比较，如果两吸收光谱的 形状和吸收峰的数目、位置、拐 点等完全一致，就可初步判定未 知物与标准物是同一种物质。
紫外-可见分光光度法的原理-定量分析
Lambert – Beer 光吸收定律：当一束平行单色光通过均匀 的样品时，其吸光度与吸光组分的浓度、吸收池的厚度乘积
紫外-可见分光光度计的组成
4 检测器 检测器的作用是检测光信号，并将光信号转
变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用 光电管或光电倍增管作为检测器。
5 信号显示系统 常用的信号显示装置有自动记录和数字显示
装置等。
仪器
可见分光光度计
仪器
紫外-可见分光光度计
紫外分光光度法的优缺点
优点：⑴灵敏度高,主要用于微量分析； ⑵准确度高,浓度测量相对误差仅有1~3%； ⑶操作简便、迅速，所需设备并不复杂； ⑷应用广泛。
紫外-可见分光光度法的原理及应用
紫外-可见分光光度法的原理
物质对光的选择吸收
当一束光照射到某种物质的固态物或溶液上时，一部 分光会被吸收或被反射，不同的物质对于照射它们的光束 的吸收程度是不同的，对某个波长的光吸收强烈，对另外 波长的光吸收很小或不吸收，我们把这种现象称为光的选 择吸收。
一切物质都会对可见和不可见光中的某些波长的光进 行吸收。 物质呈现各种各样颜色，就是它们对可见光
紫外-可见分光光度法的原理-定量分析
利用标准曲线法定量分析
在一定波长（λmax）下测定某物质的标准系列溶液 的吸光度作标准曲线，然后测定样品溶液的吸光度值，由 标准曲线求得样
0.80
Ax 0.60
0.40
0.20
0.00
cx
0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)
1）对照法
Ci
2.5 10
25.00 1000 1000
0.508 0.518
Ci
98.1 g
/
mL
12:58:50
2.吸收系数法
当其为百分吸收系 数E1%时
C=A/E1%L
吸光度的测量：紫外-可见分光光度计
光源
0.575
单色器 吸收池 检测器 显示
紫外-可见分光光度计的组成
1 光源 在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：
根据 Lambert- Beer定律，以该物质吸收光谱图中的λmax 为入射光，首先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液cs， 测其As，再将样品溶液推入光路，测其Ax ，则试样溶液的浓 度cx为：
cx
Ax As
cs
此法适于非经常性的分析工作，准确度不如标准曲线法。
例： 维生素B12的含量测定精密吸取B12注射液2.50mL，加水 稀释至10.00mL；另配制对照液，精密称定对照品25.00mg，加 水稀释至1000mL。在361nm处，用1cm吸收池，分别测定吸光 度为0.508和0.518，求B12注射液注射液的浓度（单位ug/mL)
800 600 500
400
3．吸收池
吸收池也称比色皿，用于盛放参比溶液或待测 溶液。它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、 厚度相等的玻璃制成的，按其厚度分为0.5 cm， 1 cm，2 cm，3 cm和5 cm。在可见光区测量吸 光度时使用玻璃吸收池，紫外区则使用石英吸收 池。使用比色皿时应注意保持清洁、透明，避免 磨损透光面。
紫外-可见分光光度法的原理
物质的结构决定了物质在吸收光时只能吸收某些特定波 长的光。我们可以利用测量物质对某种波长的光的吸收来了 解物质的结构特性。
用经过分光后的不同波长的光依次透过该物质，通过测 量物质对不同波长的光的吸收程度（吸光度），以波长为横 坐标，吸光度为纵坐标作图，就可以得到该物质在测量波长 范围内的吸收曲线。这种曲线体现了物质对不同波长的光的 吸收能力，称为吸收光谱。
吸收光谱
透射光 检测器
入射光 不同波长光
紫外-可见分光光度法的原理-定性分析
紫外-可见分光光度法是利用物质对光的吸收光谱，对 物质进行定性分析或定量分析的方法。按所吸收光的波长 区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称 为紫外-可见分光光度法。
不同结构的物质吸收光谱也不同，这是对物质进行定性 分析的基础：通过检测吸收光谱来比对鉴定分析物质。
缺点： ⑴仅适合微量分析； ⑵所需仪器相对昂贵。
应用
1
2
1.定性分析 各种物质具有各自不 同的分子、原子和不 同的分子空间结构， 其吸收光能量的情况 也就不会相同，因此， 每种物质就有其特有 的、固定的吸收光谱 曲线
纯度的鉴定
用紫外吸收光谱 确定试样的纯度是比 较方便的。如果一化 合物在紫外区没有吸 收峰，而其杂质有较 强吸收，就可方便的 检出该化合物中的痕 量杂质。
可见光光源，如钨灯和卤钨灯；紫外光源，如氢 灯和氘灯。
根据测定时所选用的光源： ➢可见分光光度法(400800nm) ➢紫外分光光度法(200400 nm)➢红外分光光度法(800nm50m)
氙灯
氢灯
钨灯
2 单色器 单色器以棱镜或光栅分光，提供单色光。
白光 入射狭缝 准直透镜
λ1
棱镜
λ2
聚焦透镜 出射狭缝
标准曲线法(工作曲线法)
⑴测定步骤 ①首先配制一系列被测物的标准溶液，测其
吸光度，绘出A-c工作曲线； ②在相同条件下，测出被测物的吸光度Ax; ③根据Ax的值在工作曲线上查处cx的大小。
⑵适用范围 大批重复试样的分析。
未知物的 吸光度
未知物 的浓度
紫外可见分光光度法的定量方法
单一组分的测定 （1）标准对照法
3
结构分析 紫外-可见吸收
光谱一般不用于化合 物的结构分析，但利 用紫外吸收光谱鉴定 化合物中的共轭结构 和芳环结构还是有一 定价值。
成正比.
L
入射光 I0
透射光 It
C
吸收系数
吸光系数
❖ 1．定义
❖ 一定条件下，吸光物质在单位浓度及单位 液层厚度时的吸光度，叫这个物质的吸光系数。
❖ 2．两种表示方法
❖ (1) 摩尔吸光系数(ε )：一定波长下，吸光 物质的溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时， 溶液的吸光度。
❖ (2)百分吸光系数(ελ)：一定波长下，吸光 物质的溶液浓度为1g/100ml(1%)，液层厚度为 1cm时，溶液的吸光度。
吸 光 度
波长范围
利用标准物质定性分析
在相同条件下，测定未知物 的吸收光谱，与标准物的吸收光 谱进行比较，如果两吸收光谱的 形状和吸收峰的数目、位置、拐 点等完全一致，就可初步判定未 知物与标准物是同一种物质。
紫外-可见分光光度法的原理-定量分析
Lambert – Beer 光吸收定律：当一束平行单色光通过均匀 的样品时，其吸光度与吸光组分的浓度、吸收池的厚度乘积
紫外-可见分光光度计的组成
4 检测器 检测器的作用是检测光信号，并将光信号转
变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用 光电管或光电倍增管作为检测器。
5 信号显示系统 常用的信号显示装置有自动记录和数字显示
装置等。
仪器
可见分光光度计
仪器
紫外-可见分光光度计
紫外分光光度法的优缺点
优点：⑴灵敏度高,主要用于微量分析； ⑵准确度高,浓度测量相对误差仅有1~3%； ⑶操作简便、迅速，所需设备并不复杂； ⑷应用广泛。
紫外-可见分光光度法的原理及应用
紫外-可见分光光度法的原理
物质对光的选择吸收
当一束光照射到某种物质的固态物或溶液上时，一部 分光会被吸收或被反射，不同的物质对于照射它们的光束 的吸收程度是不同的，对某个波长的光吸收强烈，对另外 波长的光吸收很小或不吸收，我们把这种现象称为光的选 择吸收。
一切物质都会对可见和不可见光中的某些波长的光进 行吸收。 物质呈现各种各样颜色，就是它们对可见光
紫外-可见分光光度法的原理-定量分析
利用标准曲线法定量分析
在一定波长（λmax）下测定某物质的标准系列溶液 的吸光度作标准曲线，然后测定样品溶液的吸光度值，由 标准曲线求得样
0.80
Ax 0.60
0.40
0.20
0.00
cx
0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)
1）对照法
Ci
2.5 10
25.00 1000 1000
0.508 0.518
Ci
98.1 g
/
mL
12:58:50
2.吸收系数法
当其为百分吸收系 数E1%时
C=A/E1%L
吸光度的测量：紫外-可见分光光度计
光源
0.575
单色器 吸收池 检测器 显示
紫外-可见分光光度计的组成
1 光源 在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：
根据 Lambert- Beer定律，以该物质吸收光谱图中的λmax 为入射光，首先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液cs， 测其As，再将样品溶液推入光路，测其Ax ，则试样溶液的浓 度cx为：
cx
Ax As
cs
此法适于非经常性的分析工作，准确度不如标准曲线法。
例： 维生素B12的含量测定精密吸取B12注射液2.50mL，加水 稀释至10.00mL；另配制对照液，精密称定对照品25.00mg，加 水稀释至1000mL。在361nm处，用1cm吸收池，分别测定吸光 度为0.508和0.518，求B12注射液注射液的浓度（单位ug/mL)
800 600 500
400
3．吸收池
吸收池也称比色皿，用于盛放参比溶液或待测 溶液。它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、 厚度相等的玻璃制成的，按其厚度分为0.5 cm， 1 cm，2 cm，3 cm和5 cm。在可见光区测量吸 光度时使用玻璃吸收池，紫外区则使用石英吸收 池。使用比色皿时应注意保持清洁、透明，避免 磨损透光面。