高产细菌素乳酸菌的筛选(方案)

项目一高产细菌素乳酸菌的筛选
一、概述
1、乳酸菌
乳酸菌是一群形态、代谢性能和生理学特征不完全相同的革兰氏阳性菌( G+) 的统称，在发酵碳水化合物时其代谢产物主要为乳酸。

乳酸菌形态多样，通常不运动，乳酸菌微好氧，在固体培养基上培养时，采用厌氧或低氧压可增加其在表面的生长物，乳酸菌的生长温度在20~53℃，最适温度是30~40℃，耐酸，最适pH 通常是5.5~6.2，一般pH在5.0 或更低情况下可以生长，在碱性或中性条件其生长速率降低。

2、细菌素
细菌素是由细菌在代谢过程中通过核糖体合成产生的一类具有抑菌活性的蛋白质或多肽，主要对同源和近缘的细菌有抑制作用，在产生细菌素的同时还会产生免疫蛋白，从而避免细菌素对自身细胞的杀伤作用。

乳酸菌素是乳酸菌在代谢过程中，合成并分泌到环境中的一类对革兰氏阳性菌，尤其是亲缘较近的细菌具有抑菌作用的杀菌蛋白或多肽乳酸菌素( Nisin) 是乳酸球菌代谢过程中合成和分泌的具有很强杀菌作用的物质。

作为乳酸菌细菌素，许多证据表明，Nisin对细胞主要作用在细胞质膜，而对细菌的杀菌作用是由于在菌膜上形成空洞，使膜的通透性增大。

二、实验目的
1.熟练掌握培养基的接种，抑菌试验。

2.掌握培养基的配制原则与方法。

3.了解牛津杯法，并能规范操作相关步骤。

三、实验内容
1.材料与试剂
泡菜
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌
1mol/L NaOH、和HCl溶液、pH试纸、木瓜蛋白酶、双氧水
2．培养基
①MRS培养基: 蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸氢二铵2g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、乙酸
钠5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18g、蒸馏水1000mL,
②牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3.00g、蛋白胨5.00g、NaCl3.00g、蒸馏水1000ml、琼脂粉8.00g、115℃灭菌20min。

③石蕊牛奶培养基：牛奶培养基(牛奶培养基的制备取脱脂奶粉，制成10%的溶液) ，每100ml中加入
2.50ml石蕊乙醇溶液( 取石蕊20g，研磨后置锥形瓶中，加入40%乙醇150ml，煮沸1min，倒出上层液，再加入40%乙醇150ml，煮沸1min，倒出上层液，与第1次倒出液合并，再以40%乙醇加至全量为300ml，滴加1mol/L 盐酸，随加随振摇，至溶液变紫色为止,pH6.0~8.0，混匀，取5~10ml分装于试管中，115℃灭菌20min。

3.实验器材
平皿，试管，锥形瓶，移液管（1ml,5ml,10ml）,洗耳球，容量瓶，试管架，酒精灯，超净台，烧杯，牛津杯，无菌滴管，水浴锅，玻璃棒，电炉，离心机，镊子，滤纸，天平电热恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、电热恒温水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱
4.实验方案
样品处理：
1）吸取泡菜水1ml，加入装有9ml无菌水的试管中，振摇均匀，制成稀释度为10-1菌悬液。

2）在无菌条件下，用无菌吸管吸取菌悬液1ml，加入到9ml的无菌水中，制成的10-2菌悬液，依照上述操作按10-3、10-4、10-5 的稀释倍数将样品稀释。

抑菌乳酸菌的初筛:
1）吸取不同浓度菌悬液1ml接种到有碳酸钙的MRS固体培养基上（称取碳酸钙20.00g加入到100ml蒸馏水中制成乳浊液，灭菌。

倒平板前，待培养基融化冷却后，平板上加入一定量的碳酸钙乳浊液，晾干后接种。

），30℃培养18h.
2）挑取有碳酸钙溶解圈的过氧化氢阴性菌落，然后接种在固体MRS平板上，每皿点种6个，培养24h后，长出圆形的菌斑，冰箱保存待用。

将指示菌在牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养20h，取该菌悬液0.1ml与5.0ml 经熔化后保持在45℃左右的牛肉膏蛋白胨固体培养基混和均匀后，立即倒入上述接有被检验菌的平板上，37℃培养12h，根据被检验菌斑周围是否形成抑菌圈来判断被检菌抗性物质的产生。

3）将能够产生抑菌圈的被检菌株接种在5.0ml的MRS液体培养基中,30℃培养18h，在MRS固体培养基上划线分离，进行纯化，挑取单菌落进行镜检。

乳酸菌的鉴定：
将菌种接种到5~10ml的石蕊牛奶培养基中，在37℃培养48h，石蕊应被还原为无色，牛奶应呈正常凝固
现象，培养基上层表面应呈紫红色环。

（菌种在培养基中的形态特征和用革兰氏染色法在显微镜下观察到的菌种形态以及菌种的生化指标对照乳酸菌鉴定手册鉴定。

）
发酵液的制备：
将筛选所得的菌活化培养后，以1%的接种量接种到MSR液体培养基中，30℃静置培养24h后，12000r/min 离心 5min，收集的上清液即为发酵液.以下试验的发酵液均采用此操作。

乳酸菌抑菌性质分析：（牛津杯法）
1）用镊子夹取牛津杯于平皿的适宜位置；
2）等待5min后，用滴管向牛津杯中滴加上清液（2个），在另外两个牛津杯中分别滴加无菌水和阳性试剂；
3）将滤纸置于牛津杯上吸去多余液体；
4）将平皿放于37℃的培养箱中培养24-48h。

酸抑制作用的排除：
测定原发酵上清液的pH，用1mol/LnaOH或1mol/LHCl将发酵液pH调至7.0在该条件下测定其抑菌活性，从而可排除酸抑制作用的影响。

过氧化氢作用的排除：
取待测菌种株的发酵液200μl，将发酵上清液在80℃保温10min来排除过氧化氢的干扰，以未处理的发酵液作对照，测定2种发酵液的抑活性。

蛋白酶敏感性试验：
分别取菌株的发酵上清液200μl，利用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节发酵液到木瓜蛋白酶的最适pH7.0，加入终浓度为1.0mg/mL的木瓜蛋白酶，37℃消化2h，再将已处理发酵液pH调至原发酵液pH，以未处理的发酵液作对照，用牛津杯双层平板法测定抑菌活性。

四、结果记录
1、产抑菌物质菌株的筛选按照试验方法从泡菜中分离出) 株产酸菌，选出其中1株抑菌效果较好的菌株，编号为Y。

2、菌种鉴定
观察QY菌落形态特征
抑菌活性
对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果：。