实验二 细菌的鉴定方法
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4. 放射免疫测定技术。放射免疫测定(RIA，Radio immuno assay)是用放射性同位素标记抗原或抗 体，与相应的抗体或抗原结合后通过放射自显影 定性和定量抗原或抗体。
5. 免疫胶体金标记技术。胶体金是继酶、荧 光素和放射同位素后免疫标记技术中令人 瞩目的新标记物。胶体金是氯金酸 (HAuC14)在还原剂如白磷、枸橼酸钠等的 作用下，聚合成特定大小的金颗粒，通过 静电作用与抗体或抗原形成一种稳定的胶 体状态，即为免疫金，免疫金与相应的抗 原抗体结合后，呈现特定的颜色反应。
2. 免疫酶技术。免疫酶技术(EIA，Enzyme immuno assay) 是将酶标记的抗抗体与抗原一抗体复合物结合形成抗原一 抗体一酶标记抗抗体复合物，加入酶底物产生有色产物。 以酶联免疫吸附测定(ELISA)和斑点酶联免疫吸附技术 (Dot—EusA)应用较广泛。
3. 免疫荧光技术 免疫荧光技术(FIA，Fuorescence immunoassay)是将一抗滴加于待检抗原上，再 加一抗的荧光抗体(二抗)，呈现特异性的荧光抗原 抗体复合物以鉴定病原菌。此法比ELISA更直观， 可直接观察到菌体形态。
❖ 微生物全基因组测序 是当前国际生命科学领 域中掌握微生物全部遗传信息的最佳途径。 1990年10月1日人类基因组计划(HGP， HumanGenone Project)的正式启动极大地 推动了微生物基因组学和微生物蛋白质组学 的飞速发展，1995年7月首次报道了流感嗜 血杆菌的全基因组序列(1.8 Mb)，至今已正 式公布的微生物基因组序列有53种，正在进 行的至少有100余种，由此迎来了“后基因 组生物学时代”。
三、化学分类鉴定法
20世纪50年代中期由Cummins和Harris建立起来 的化学分类鉴定法，主要通过细菌细胞壁化学成分 即氨基酸和糖的分析进行分类鉴定，属的分类主要 测定各种氨基酸组分，种的鉴定主要是对糖的分析。 另外，还有全细胞水解液糖型分析、脂肪酸分析、 磷酸类脂成分分析、枝菌酸分析、醌类分析和光合 色素成分分析等，常使用红外光谱、气相色谱、高 效液相色谱和质谱等新技术。
❖ 限制性核酸内切酶分析法 (REA，Restriction Enzyme Analysis)是用限制性内切酶消化不同细 菌染色体DNA产生不同长度限制性片段的酶切图谱， 将图谱与已知菌进行比较鉴定细菌。
❖ 质粒图谱分析法 质粒是独立于细菌染色体之外进行
复制的辅助性遗传单位，不是细菌生长繁殖所必需 的，但质粒可使宿主菌具有某些非染色体决定的生 物学性状如耐药性、溶血性、细菌毒力等。质粒图 谱分析(PP分析，Plasmid Profile Analysis)是通 过比较电泳图谱上质粒DNA数目和分子量分析细菌， 该法特异性好、分析周期短、稳定可靠，几乎适用 于所有细菌的分型，特别适用于尚未建立标准分型 方法和缺乏血清型的菌属(种)的鉴定和分型。
❖ 脉冲场凝胶电泳分析法 (PFGE，Pulsed—field Gel Electrophoresis)采用定时改变电场方向的交 变电源，每次电流方向改变后持续1～5 S再改变电 流方向，如此反复循环。PFGE运用罕见切点的内 切酶切割染色体DNA，产生10～800 kb长的5～20 条大的DNA片段。PFGE是目前分辨力最高的分型 方法之一，但技术要求高。
一、细菌常规鉴定法
细菌常规鉴定法是细菌形态和生理生化 水平及蛋白质水平的鉴定，前者是最经典、 最常用的分类鉴定指标，也是现代化分类鉴 定的依据，后者包括免疫诊断技术、蛋白质 图谱分析和氨基酸序列分析等。
免疫诊断技术
1. 凝集试验 目前常用的是葡萄球菌协同凝集试验(SPA— CoA)，金黄色葡萄球菌细胞壁的A蛋白(sPA)能与动物血清 中IgG的Fc结合，成为致敏的颗粒载体，特异性IgG的Fc与 SPA结合后，F(ab’)2段暴露在葡萄球菌表面，与相应细菌 反应呈现凝集现，此法用于细菌快速鉴定和分型。
❖ PCR技术 在模板、引物和4种脱氧核苷酸存在的 条件下依赖DNA聚合酶的酶促反应，包括高温变性、 低温复性和中温延伸3个阶段，经25～30个循环， 原始模板可扩增106以上。锚定PCR、反向PCR、 多重PCR、原位PCR、不对称PCR、重复序列PCR、 巢式PCR、反转录PCR、差异显示PCR、免疫PCR、 PCR—ELISA、随机扩增DNA多态性分析(RAPD) 和扩增片段长度多态性(AFLP)等。
❖ “Bidog”细菌鉴定系统由不同氧化还原指示剂和发酵性碳 源的培养基干粉组成96孔细菌培养板。将待检菌的新鲜纯培 养物配制成适当浓度的菌悬液，由多头接种器快速完成96孔 接种，37 ℃培养4～24 h，置检察室的分光光度计中检测， 计算机自动分析该菌的“指纹图谱”得出鉴定结果。此系统 适用于动植物检疫，医学临床检验及食品、饮水卫生的监控 等。
❖ 目前应用较多的自动化鉴定系统主要有：
Vitek—AMS(Automated Microbic System ) 、Biolog、MicroScan、 Enterotube、MIDI、Sensititte、 Autoseeptor、Crystal等鉴定系统。
❖ 法国生物一梅里埃(Bio—Merieux)公司的Vitek—AMS系统 是应用最普遍的细菌自动化鉴定系统之一，可鉴定18 000多 种细菌。全自动鉴定是从接种、培养、读数到报告的全过程 自动完成，利用负压将菌液加入测试卡各孔，封口机封口， 置孵箱孵育，阅读器以665 nm波长每小时将测试卡拉出1次 对各孔底物进行光扫描，动态观察其变化，计算机将判读结 果与标准数据库比较得出鉴定结果。
❖ 16SrRNA序列和16S一23SrRNA间区序列分析法 rRNA是研究细菌进化和亲源关系的重要指标，含 量大(约占细菌RNA总量的80％)，素有“细菌化石” 之称，是细菌系统分类学最有用和常用的分子钟。 原核生物的5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA位于同 一操纵子上，其中16SrRNA为细胞所共有，分子大 小适合操作，其功能同源且最为古老，既含保守序 列又含可变序列。保守性反映生物物种的亲源关系， 为系统发育提供线索；高变性则揭示生物物种的特 征核酸序列，是种属鉴定的分子基础，其序列变化 与进化距离相对应，在细菌种属分类鉴定中广泛应 用。16SrRNA序列分析是一种非培养分析技术，能 快速鉴定目前尚不能人工培养的微生物。若两菌的 16SrRNA同源性大于99％ ，且染色体DNA杂交率 大于70％ ，基因水平上为同一种细菌。
Baidu Nhomakorabea
❖ 蛋白质图谱分析
蛋白质图谱分析主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE， Polyacrylamide Gel Electrophoresis)和SDS—PAGE。聚 丙烯酰胺凝胶是单体丙烯酰胺(Acr)和N，N’一亚甲双丙烯酰 胺(Bis)在催化剂过硫酸铵和加速剂四甲基乙二胺(TEMED) 作用下聚合为含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻长链通过甲 叉桥连接形成三维网状结构物质，PAGE根据电荷、形状和 分子大小分离和定性、定量分析蛋白质和多肽。SDS— PAGE根据分子量的不同分离蛋白质，SDS是一种阴离子表 面活性剂，与蛋白质疏水部分结合使蛋白质带大量负电荷且 使蛋白质的形状趋向一致，抵消了蛋白质本身所带电荷和形 状的影响，因此，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率 呈直线关系。
分离菌株DNA 快速制备取1.5 mL 病菌LB 培养物在 离心机以4 000 r·min-1 离心5 min, 用0.2 mL TE 缓 冲液重悬沉淀, 加入400 μL 1%的SDS和400 μL 10 mg·mL- 1 的蛋白酶K, 混匀后于65℃温育30 min(其 间轻摇几次)。取上清液, 加入等体积的苯酚/氯仿/异 戊醇混匀, 静置5 min。12 000 r·min- 1室温离心5 min。取上清液, 转入一支新的离心管中, 加入0.8 体 积异丙醇, 轻轻混匀, 4℃静置30min。4℃1 500 r·min- 1 离心30 min。然后沉淀用500μL 70%乙醇 洗涤1 次, 10 000 r·min- 1 离心5 min。沉淀晾干 ( 37℃, 20 min) 后用100 μL TE 溶解, 4℃冷藏。
实验二 细菌的鉴定方法
❖ 细菌分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴 定法两大类，分成4个水平：细菌形态和生理生化 水平、细胞组分水平、蛋白质水平和核酸水平。
❖ 表型鉴定法是对前3个水平的鉴定，包括常规鉴定 法、数值分类鉴定法和化学分类鉴定法。
❖ 分子遗传学鉴定法是核酸水平的鉴定，对细菌染色 体或质粒DNA进行分析，包括G+Cmo1％ 含量测 定、核酸杂交、PCR技术、16SrRNA和16～ 23SrRNA序列分析、全基因组测序等，此类方法使 细菌种属定位和亲源关系判别由表型特征深化为基 因型鉴定。
二、细菌的数值分类和自动化鉴定
❖ 数值分类法是近20年来发展起来的细菌分类理论，它应用大 量已知菌对相关生化试验反应出现的频率得出数据进行分析， 优化组合数10项生理生化指标集合成套试剂，根据相似系数 大小判断细菌种属间的亲源性。
❖ 自动化微生物鉴定系统即采用数值分类原理。微生物数值分 类鉴定集数学、电子、信息及自动分析技术于一体，具有系 统化、标准化、微量化和简易化等优点，采用商品化的鉴定 测试卡，将未知菌鉴定到属、种、亚种或生物型，可对不同 来源的临床标本进行针对性鉴定，所得结果以数字方式表达， 与数据库数据(手册或软件)对比得出鉴定结果。
四、分子遗传学分类鉴定法
❖ 细菌染色体DNA G+Cmo1％含量测定细菌染色体DNA G+C mo1％含量测定对表型相似的疑难菌株鉴定、新的分类单位 建立和细菌亲源关系判定等是一项重要的分类鉴定指标和参 考标准，包括纸层析法、浮力密度法、高效液相色谱法、热 变性温度(Tm)法和荧光法等。
❖ 核酸杂交技术 根据碱基互补配对原理，将2条不同来源的 单链核酸进行复性以鉴定菌株间的亲源关系，用于DNADNA、DNA-RNA和PNA-DNA杂交(PNA为肽核酸)。DNADNA杂交适用于种水平的研究，而DNA-rRNA杂交用于属 和属以上水平的分类研究。一般认为核酸杂交同源性小于20 ％为不同菌属，20％ ～60％ 为属内紧密相关的种，60％ ～ 70％为同种内不同亚种，大于70％为同一亚种。另外，对 线粒体DNA(mtDNA)进行杂交分析将对种内和种间的分类 更加灵敏。
5. 免疫胶体金标记技术。胶体金是继酶、荧 光素和放射同位素后免疫标记技术中令人 瞩目的新标记物。胶体金是氯金酸 (HAuC14)在还原剂如白磷、枸橼酸钠等的 作用下，聚合成特定大小的金颗粒，通过 静电作用与抗体或抗原形成一种稳定的胶 体状态，即为免疫金，免疫金与相应的抗 原抗体结合后，呈现特定的颜色反应。
2. 免疫酶技术。免疫酶技术(EIA，Enzyme immuno assay) 是将酶标记的抗抗体与抗原一抗体复合物结合形成抗原一 抗体一酶标记抗抗体复合物，加入酶底物产生有色产物。 以酶联免疫吸附测定(ELISA)和斑点酶联免疫吸附技术 (Dot—EusA)应用较广泛。
3. 免疫荧光技术 免疫荧光技术(FIA，Fuorescence immunoassay)是将一抗滴加于待检抗原上，再 加一抗的荧光抗体(二抗)，呈现特异性的荧光抗原 抗体复合物以鉴定病原菌。此法比ELISA更直观， 可直接观察到菌体形态。
❖ 微生物全基因组测序 是当前国际生命科学领 域中掌握微生物全部遗传信息的最佳途径。 1990年10月1日人类基因组计划(HGP， HumanGenone Project)的正式启动极大地 推动了微生物基因组学和微生物蛋白质组学 的飞速发展，1995年7月首次报道了流感嗜 血杆菌的全基因组序列(1.8 Mb)，至今已正 式公布的微生物基因组序列有53种，正在进 行的至少有100余种，由此迎来了“后基因 组生物学时代”。
三、化学分类鉴定法
20世纪50年代中期由Cummins和Harris建立起来 的化学分类鉴定法，主要通过细菌细胞壁化学成分 即氨基酸和糖的分析进行分类鉴定，属的分类主要 测定各种氨基酸组分，种的鉴定主要是对糖的分析。 另外，还有全细胞水解液糖型分析、脂肪酸分析、 磷酸类脂成分分析、枝菌酸分析、醌类分析和光合 色素成分分析等，常使用红外光谱、气相色谱、高 效液相色谱和质谱等新技术。
❖ 限制性核酸内切酶分析法 (REA，Restriction Enzyme Analysis)是用限制性内切酶消化不同细 菌染色体DNA产生不同长度限制性片段的酶切图谱， 将图谱与已知菌进行比较鉴定细菌。
❖ 质粒图谱分析法 质粒是独立于细菌染色体之外进行
复制的辅助性遗传单位，不是细菌生长繁殖所必需 的，但质粒可使宿主菌具有某些非染色体决定的生 物学性状如耐药性、溶血性、细菌毒力等。质粒图 谱分析(PP分析，Plasmid Profile Analysis)是通 过比较电泳图谱上质粒DNA数目和分子量分析细菌， 该法特异性好、分析周期短、稳定可靠，几乎适用 于所有细菌的分型，特别适用于尚未建立标准分型 方法和缺乏血清型的菌属(种)的鉴定和分型。
❖ 脉冲场凝胶电泳分析法 (PFGE，Pulsed—field Gel Electrophoresis)采用定时改变电场方向的交 变电源，每次电流方向改变后持续1～5 S再改变电 流方向，如此反复循环。PFGE运用罕见切点的内 切酶切割染色体DNA，产生10～800 kb长的5～20 条大的DNA片段。PFGE是目前分辨力最高的分型 方法之一，但技术要求高。
一、细菌常规鉴定法
细菌常规鉴定法是细菌形态和生理生化 水平及蛋白质水平的鉴定，前者是最经典、 最常用的分类鉴定指标，也是现代化分类鉴 定的依据，后者包括免疫诊断技术、蛋白质 图谱分析和氨基酸序列分析等。
免疫诊断技术
1. 凝集试验 目前常用的是葡萄球菌协同凝集试验(SPA— CoA)，金黄色葡萄球菌细胞壁的A蛋白(sPA)能与动物血清 中IgG的Fc结合，成为致敏的颗粒载体，特异性IgG的Fc与 SPA结合后，F(ab’)2段暴露在葡萄球菌表面，与相应细菌 反应呈现凝集现，此法用于细菌快速鉴定和分型。
❖ PCR技术 在模板、引物和4种脱氧核苷酸存在的 条件下依赖DNA聚合酶的酶促反应，包括高温变性、 低温复性和中温延伸3个阶段，经25～30个循环， 原始模板可扩增106以上。锚定PCR、反向PCR、 多重PCR、原位PCR、不对称PCR、重复序列PCR、 巢式PCR、反转录PCR、差异显示PCR、免疫PCR、 PCR—ELISA、随机扩增DNA多态性分析(RAPD) 和扩增片段长度多态性(AFLP)等。
❖ “Bidog”细菌鉴定系统由不同氧化还原指示剂和发酵性碳 源的培养基干粉组成96孔细菌培养板。将待检菌的新鲜纯培 养物配制成适当浓度的菌悬液，由多头接种器快速完成96孔 接种，37 ℃培养4～24 h，置检察室的分光光度计中检测， 计算机自动分析该菌的“指纹图谱”得出鉴定结果。此系统 适用于动植物检疫，医学临床检验及食品、饮水卫生的监控 等。
❖ 目前应用较多的自动化鉴定系统主要有：
Vitek—AMS(Automated Microbic System ) 、Biolog、MicroScan、 Enterotube、MIDI、Sensititte、 Autoseeptor、Crystal等鉴定系统。
❖ 法国生物一梅里埃(Bio—Merieux)公司的Vitek—AMS系统 是应用最普遍的细菌自动化鉴定系统之一，可鉴定18 000多 种细菌。全自动鉴定是从接种、培养、读数到报告的全过程 自动完成，利用负压将菌液加入测试卡各孔，封口机封口， 置孵箱孵育，阅读器以665 nm波长每小时将测试卡拉出1次 对各孔底物进行光扫描，动态观察其变化，计算机将判读结 果与标准数据库比较得出鉴定结果。
❖ 16SrRNA序列和16S一23SrRNA间区序列分析法 rRNA是研究细菌进化和亲源关系的重要指标，含 量大(约占细菌RNA总量的80％)，素有“细菌化石” 之称，是细菌系统分类学最有用和常用的分子钟。 原核生物的5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA位于同 一操纵子上，其中16SrRNA为细胞所共有，分子大 小适合操作，其功能同源且最为古老，既含保守序 列又含可变序列。保守性反映生物物种的亲源关系， 为系统发育提供线索；高变性则揭示生物物种的特 征核酸序列，是种属鉴定的分子基础，其序列变化 与进化距离相对应，在细菌种属分类鉴定中广泛应 用。16SrRNA序列分析是一种非培养分析技术，能 快速鉴定目前尚不能人工培养的微生物。若两菌的 16SrRNA同源性大于99％ ，且染色体DNA杂交率 大于70％ ，基因水平上为同一种细菌。
Baidu Nhomakorabea
❖ 蛋白质图谱分析
蛋白质图谱分析主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE， Polyacrylamide Gel Electrophoresis)和SDS—PAGE。聚 丙烯酰胺凝胶是单体丙烯酰胺(Acr)和N，N’一亚甲双丙烯酰 胺(Bis)在催化剂过硫酸铵和加速剂四甲基乙二胺(TEMED) 作用下聚合为含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻长链通过甲 叉桥连接形成三维网状结构物质，PAGE根据电荷、形状和 分子大小分离和定性、定量分析蛋白质和多肽。SDS— PAGE根据分子量的不同分离蛋白质，SDS是一种阴离子表 面活性剂，与蛋白质疏水部分结合使蛋白质带大量负电荷且 使蛋白质的形状趋向一致，抵消了蛋白质本身所带电荷和形 状的影响，因此，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率 呈直线关系。
分离菌株DNA 快速制备取1.5 mL 病菌LB 培养物在 离心机以4 000 r·min-1 离心5 min, 用0.2 mL TE 缓 冲液重悬沉淀, 加入400 μL 1%的SDS和400 μL 10 mg·mL- 1 的蛋白酶K, 混匀后于65℃温育30 min(其 间轻摇几次)。取上清液, 加入等体积的苯酚/氯仿/异 戊醇混匀, 静置5 min。12 000 r·min- 1室温离心5 min。取上清液, 转入一支新的离心管中, 加入0.8 体 积异丙醇, 轻轻混匀, 4℃静置30min。4℃1 500 r·min- 1 离心30 min。然后沉淀用500μL 70%乙醇 洗涤1 次, 10 000 r·min- 1 离心5 min。沉淀晾干 ( 37℃, 20 min) 后用100 μL TE 溶解, 4℃冷藏。
实验二 细菌的鉴定方法
❖ 细菌分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴 定法两大类，分成4个水平：细菌形态和生理生化 水平、细胞组分水平、蛋白质水平和核酸水平。
❖ 表型鉴定法是对前3个水平的鉴定，包括常规鉴定 法、数值分类鉴定法和化学分类鉴定法。
❖ 分子遗传学鉴定法是核酸水平的鉴定，对细菌染色 体或质粒DNA进行分析，包括G+Cmo1％ 含量测 定、核酸杂交、PCR技术、16SrRNA和16～ 23SrRNA序列分析、全基因组测序等，此类方法使 细菌种属定位和亲源关系判别由表型特征深化为基 因型鉴定。
二、细菌的数值分类和自动化鉴定
❖ 数值分类法是近20年来发展起来的细菌分类理论，它应用大 量已知菌对相关生化试验反应出现的频率得出数据进行分析， 优化组合数10项生理生化指标集合成套试剂，根据相似系数 大小判断细菌种属间的亲源性。
❖ 自动化微生物鉴定系统即采用数值分类原理。微生物数值分 类鉴定集数学、电子、信息及自动分析技术于一体，具有系 统化、标准化、微量化和简易化等优点，采用商品化的鉴定 测试卡，将未知菌鉴定到属、种、亚种或生物型，可对不同 来源的临床标本进行针对性鉴定，所得结果以数字方式表达， 与数据库数据(手册或软件)对比得出鉴定结果。
四、分子遗传学分类鉴定法
❖ 细菌染色体DNA G+Cmo1％含量测定细菌染色体DNA G+C mo1％含量测定对表型相似的疑难菌株鉴定、新的分类单位 建立和细菌亲源关系判定等是一项重要的分类鉴定指标和参 考标准，包括纸层析法、浮力密度法、高效液相色谱法、热 变性温度(Tm)法和荧光法等。
❖ 核酸杂交技术 根据碱基互补配对原理，将2条不同来源的 单链核酸进行复性以鉴定菌株间的亲源关系，用于DNADNA、DNA-RNA和PNA-DNA杂交(PNA为肽核酸)。DNADNA杂交适用于种水平的研究，而DNA-rRNA杂交用于属 和属以上水平的分类研究。一般认为核酸杂交同源性小于20 ％为不同菌属，20％ ～60％ 为属内紧密相关的种，60％ ～ 70％为同种内不同亚种，大于70％为同一亚种。另外，对 线粒体DNA(mtDNA)进行杂交分析将对种内和种间的分类 更加灵敏。