抗乙型肝炎病毒非核苷类药物的研究进展

抗乙型肝炎病毒非核苷类药物的研究进
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【关键词】抗乙型肝炎病毒非核苷类药物
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引起的一种常见的世界性传染疾病。

HBV一直严重危害人类健康，至今仍是世界性的医学难题。

全世界大约有20亿乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染者，每年由于HBV感染而死亡的人数达100万［1］。

目前，临床上应用的干扰素和核苷类抗HBV药物虽然在治疗乙肝病毒的过程中取得了一定的疗效，但免疫调节剂的低应答率和核苷类似药物耐药性病毒株的出现以及停药反弹等因素使其应用受到了限制。

非核苷类化合物种类繁多，结构不一［2］，抗HBV的作用机制不同于核苷类药物，且有许多具有较好的抗HBV活性。

因此近年来，非核苷类抗HBV药物的研究已引起广泛关注，本文对它们的最新研究进展作一简单综述。

1 焦磷酸类似物
膦甲酸钠是最常用的焦磷酸类似物。

它是特异性DNA聚合酶的非竞争性抑制剂，对人类巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒等均有抑
制作用。

膦甲酸钠能直接作用于核酸聚合酶的焦磷酸结合部位，抑制病毒特异DNA多聚酶和逆转录酶。

有研究者给21例乙肝患者注射国产膦甲酸钠，每天4.8 g，分两次(每次间隔6 h)静滴，注射前后同步检测HBV复制指标。

治疗结束后HBeAg和HBV-DNA转阴率分别为35.2％和33.3％［3］。

2 γ-联苯双酯
γ-联苯双酯(γ-DDB，4,4’-二甲氧基-5,6,5’,6’-双亚甲二氧基-2,2’-二羧酸甲酯联苯)为我国首创治疗慢性肝炎的药物。

尽管该化合物有口服吸收率低的缺点，但活性很好。

γ-联苯双酯具有肝脏保护作用，能使肝脏免受四氯化碳，D-半乳糖氨引起的肝损伤，降低血清GPT(谷氨酸丙酮酸转氨酶)和GOT(谷氨酸草酰乙酸转氨酶)，增强肝脏解毒功能。

初步试验表明［4］，单酯化合物较双酯化合物活性更强。

3 苯丙氨衍生物
文献报道苯丙氨衍生物(E)-N-(1-溴-1-(2-甲氧苯基)-3-氧代-3-(哌啶-1-基)丙-1-烯-2-基)-4-硝基。

苯甲酰胺(EC50=2.4 μmol·L-1)对原生型和耐拉米夫定的HBV变种有较好的抑制作用。

推断其通过抑制带有病毒壳体蛋白信息的RNA合成而发挥抗HBV作用［5］。

4 2,5-吡啶羧酸衍生物
Lee［6］等在非核苷类HIV逆转录酶抑制剂的研究基础上开发了一类新型HBV逆转录酶抑制剂，其中2,5-吡啶羧酸衍生物N-(1-羟基-2-
甲基丙基-2-基)-6-(4-(3-(异丁基氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-羧基)烟酰胺（IC500.01 μmol·L-1，CC50100 μmol·L-1)的活性和选择性均优于核苷类似物。

5 1, 3, 4-噁二唑类化合物
早期研究表明，1, 3, 4-噁二唑类化合物具有抗RNA病毒的活性，可通过结合在微小核糖核酸病毒表面的疏水口袋上来抑制病毒附着到细胞上，并且抑制病毒的脱壳过程。

之后，Tan等［7］合成了一系列此类化合物，并对其抗HBV活性和毒性进行了评价。

发现化合物2-(2-(4-苯基哌嗪-1-基)乙基硫代)-5-(1-(苯磺酰基)丙基)-1,3,4-噁二唑(EC50=1.63 μmol·L-1，CC5040 μmol·L-1)具有良好的抗HBV活性，实验结果表明在病毒的增殖过程中该化合物并未改变病毒的转录，而细胞内病毒粒子却显著减少，推断其抗HBV活性可能作用于病毒转录后的某个过程。

6 苯并咪唑类化合物
Li等筛选出化合物2-(2-(1-(4-硝基苯磺酰基)-1H-［d］苯并咪-2-基)乙基)-2H-茚-1,3-二酮［8］(IC50=14.2 μmol·L-1，CC50=200 μmol·L-1)和化合物N-(2-氨基-1-(异丙磺酰基)-1H-［d］苯并脒-6-基)-3-(三氟甲基)苯磺酰胺［9］(IC50= 4 μmol·L-1，SI=27)均具有一定的抗HBV活性，分别以它们为先导化合物，合成了一系列具有苯并咪唑结构的化合物，并进行了抗HBV活性和毒性评价，在其中寻找到了一些活性更好且毒性更小的化合物，它们的结构与已知抗HBV 化合物的结构差异很大，其具体作用机制的研究还在进行中。

7 5-羟基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯类化合物
研究表明，5-羟基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯类化合物具有抗病毒作用，此外还可以提高免疫力。

Zhao等［10］以Arbidol为先导化合物，合成了一系列此类化合物，并以HBV感染的HepG2.2.15细胞株对它们的抗HBV活性和毒性进行了评价。

发现化合物5-羟基-1-甲基-2-((2-甲基呋喃-3-磺酰基)甲基)-4-(吡咯烷-1-甲基)-1H-吲哚-3-羧酸乙酯(IC50=1.52 mg·L-1，TC50=14.26 mg·L-1，SI=9.38)具有很好的抗HBV活性和治疗指数，其活性是拉米夫定(IC50=228 mg·L-1，TC50=1 600.00 mg·L-1，SI=7.02)的150倍，化合物4-((1H-1-咪唑基)甲基)-1-环丙基-5-羟基-2-(对甲苯磺酰甲基)-1H-吲哚-3-羧酸乙酯(IC50=15.41 mg·L-1，TC50=106.83 mg·L-1，SI=6.93)和化合物5-羟基-2-((3-甲氧苯磺酰基)甲基)-1-甲基-4-(吡咯烷-1-甲基)-1H-吲哚-3-羧酸乙酯(IC50=2.00 mg·L-1，TC50=17.7 mg·L-1，SI=8.85)同样具有良好的抗HBV活性和治疗指数。

通过构效关系分析表明：(1) 4位引入的曼尼希碱性基团对化合物的生物活性有重要影响，特别是杂环基团比如吡咯烷基，咪唑基可以提高化合物的活性；
(2)磺酰基相对于亚磺酰基更能提高化合物的活性，且对化合物的毒性影响不大；(3)2位不同芳基对化合物的抗病毒活性影响不大；(4) 6位上的溴可能不是保持化合物抗HBV活性必需的药效团。

8 6-羟基-喹啉-3-羧酸乙酯类化合物
Liu[11]等在5-羟基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯类化合物的基础上合成了该系列化合物。

通过抗HBV活性和毒性评价，结果显示它们比吲哚环
衍生物具有更好的抗HBV活性。

体外研究表明该系列的大多数化合物都具有潜在的抗HBV活性，其中化合物5-((1H-咪唑-1-基)甲基)-2-((3,4-二氟苯磺酰基)甲基)-6-羟基-7-甲氧基喹啉-3-羧酸乙酯(TC50=160.3 μM，IC50=4.7 μM，SI=34.1)的活性最突出，能抑制HBV-DNA的复制，是拉米夫定的66倍(TC50=2213.8 μM，IC50=311.2 μM，SI=7.1)。

构效关系分析表明：(1) 2位苯环上不同的取代基对化合物的生物活性可能有重要影响。

氟取代基可使化合物活性提高，而吡啶基则使其抗HBV的活性彻底消失。

(2) 5位引入不同的曼尼希碱性基团对化合物的抗HBV活性有显著影响。

(3)X位的硫变为亚磺酰基时对化合物的活性和毒性影响均不大。

因此进一步的结构改造应侧重于喹啉环5位和2位苯环，一些氮杂环如吡咯、咪唑等可被引入到喹啉环5位；2位苯环上可引入不同的卤素或S-杂芳环。

9 杂芳环取代的二氢嘧啶类化合物
杂芳环取代的二氢嘧啶类(HAP)化合物以2003年Deres等报道的Bay41-4109、Bay39-5493为代表[12]。

研究表明，该类化合物具有立体选择性，仅R型对映异构体有活性。

其作用机制是通过阻止正常核衣壳的形成起到抑制HBV的复制，并且该抑制作用也有HBV种属特异性。

对其作用机制深入研究发现，HAP并不影响核心蛋白二聚体的形成，而可能是与核心蛋白的113～143位氨基酸残基作用，改变核衣壳二聚体之间的夹角，形成脆弱的肿胀核衣壳，加速核心蛋白的降解。

其中Bay41-4109，化学名为(R)-4-(2-氯-4-氟苯基)-2-(3,5-二
氟-2-吡啶基)-6-甲基-1-二氢嘧啶-5-酸甲酯)为一个高度有效的非核苷类乙肝病毒抑制剂，口服吸收迅速，药代动力学和毒理学参数良好，高度特异性的抗病毒作用。

目前有研究报道[13]Bay41-4109作为一种新型抗HBV化合物可能会诱发鼠的肝毒性。

10 4-芳基-6-氯-2-喹啉酮类似物
早期研究表明4-芳基-2-喹啉酮类为乙酰辅酶A和胆固醇酰基转移酶抑制剂，能介导钙激活钾通道的开放。

Cheng[2]3787-3789等筛选得到化合物6-氯-4苯基喹啉-2(1H)-酮(IC50=0.458 mM，SI=2.6)并以6-氯-4苯基喹啉-2(1H)-酮为先导化合物合成了一系列4-芳基-6-氯-2-喹啉酮类似物，并对其抗HBV活性和毒性进行了评价。

在其中寻找到了活性更好且毒性更小的化合物6-氯-4-(2-氟苯基)-3-(2-羟乙基)喹啉-2(1H)-酮和6-氯-4-(2-氯苯基)-3-(2-羟乙基)喹啉-2(1H)-酮，并且有望成为新型非核苷类抗HBV药物。

11 天然抗HBV单一有效成分
11.1 赛菊芋黄素及其类似物
赛菊芋黄素为一芳基萘木聚糖内酯，是从台湾柳杉中提取的抑制病毒复制的天然活性成分。

其不仅抑制HBV-DNA(EC50=0.08 μmol·L-1)的复制，还可降低HBV感染的细胞中mRNA (EC50=0.09 μmol·L-1)和蛋白质的含量。

Cheng等对其进行衍生化研究，得对野生型及耐拉米夫定的HBV同样有抑制作用的化合物(5-[d]苯并[1,3]二氧戊烷基)-[d][1,3]二氧戊环并[f]苯并(2,3-二氢)异吲哚-1-酮。

此外，Yeo 等合成了一系列此类化合物，发现它们具有抗HBV，HCV和HIV活性，
其中化合物(5-[d]苯并[1,3]二氧戊烷基)-[d][1,3]二氧戊环并[g]苯并(2,3-二氢)酞嗪-1,4-二酮(EC50=0.03 μmol·L-1，IC50=0.08 μmol·L-1，SI＞100)，表现出强大的抗HBV活性，可抑制HBV-RNA 和蛋白的表达，并且对野生型及耐拉米夫定的HBV同样具有抑制作用[14]。

研究显示[15]，该化合物进入体内后依次阻断病毒RNA、蛋白、DNA的表达。

其抗HBV作用机制：通过降低结合在前核心/核心增强子II区的肝细胞核因子4(HNF-4）、肝细胞核因子3(HNF-3)和胎蛋白因子，抑制HBV启动子的活性及HBV阳性细胞中HNF-4及HNF-3的表达，但对阴性细胞无作用。

因此，其是通过下调逆转录因子抑制HBV 复制，从而降低HBV启动子活性和阻止病毒基因的表达和复制。

该作用机制很独特，有别于其他抗乙肝病毒的化合物。

11.2 青蒿素酯
Romero等[15]用HepG2.2.2.15细胞株对大量高纯度中药单一有效成分进行了抗HBV活性评价，发现：青蒿素酯(CC50=20 μmol·L-1，HBsAgIC50=2.3 μmol·L-1，HBV-DNAIC50=0.5 μmol·L-1，TI=40)与拉米夫定(CC50100 μmol·L-1，HBsAgIC50=0.2 μmol·L-1，HBV-DNAIC50=0.3 μmol·L-1，TI500)相比抗HBV活性较弱，但两者联合使用时，呈现协同作用，同时没有发现引起新的毒性，而且青蒿素酯可在不影响宿主细胞增殖的情况下强烈抑制HBV。

11.3 苦参素
苦参素为豆科植物苦参根提取的有效成份，98%为氧化苦参碱。

苦参素有抑制胶原纤维增生的抗纤维化作用，能保护肝细胞，降低ALT、
LN、HA水平。

临床应用苦参碱注射液治疗慢性乙型肝炎。

结果显示，两个月后患者体征、肝功能明显改善，HBeAg阴转率可达51%，且复发率较低[16]。

11.4 4-甲基-7-羟基香豆素衍生物
Chen等[17]在筛选抗HIV药物时，以4-甲基-7-羟基香豆素为先导物合成了12个4-甲基-7-硫基香豆素类似物，并以HBV感染的HepG2.2.15细胞株对它们的抗HBV活性和毒性进行评价。

其中，10个化合物表现出良好的抗HBV活性，而化合物4-甲基-7-(3-甲基丁基-2-烯硫基)-2H-香豆素-2-酮(IC50=0.01 μmol·L-1)和7-(6-氯-1-N-氧吡啶基-2-硫基)-4-甲基--2H-香豆素-2-酮(IC50=0.01 μmol·L-1)是拉米夫定的16 倍。

目前此类化合物的作用机制尚在进一步研究中。

11.5 泽泻醇A衍生物
Zhang等[18]合成一系列泽泻醇A衍生物，并对其抗HBV的活性进行了体外评价。

研究表明，对泽泻醇A的母核结构进行简单修饰即可得到一些对乙肝病毒有潜在抑制作用的重要衍生物。

其中将泽泻醇A11,23,24位的羟基乙酯化、13,17位双键环氧化、25位羟基脱水后得到的化合物活性最突出(HBsAgIC50=0.024 mM，HBeAgIC50=0.028 mM，HBsAgSI108，HBeAgSI93)远远优于拉米夫定(HBsAgIC50=12 mM，HBeAgIC50=26 mM)，可作为一种新型乙肝病毒抑制剂对其作进一步研究。

构效关系分析发现：(a)11，23，24位羟基酰化可降低此类化合物的毒性；(b)在C-13(17)的环氧基对化合物的毒性有重要影响，使
毒性相对降低；(c)进一步结构优化位置在泽泻醇A的C-25羟基；
(d)C-3位羰基对化合物的生物活性影响不大。

11.6 丹参中原儿茶醛[19]
原儿茶醛(Protocatechuic aldehyde，PA)是从中草药丹参中得到的一种成分。

其不仅可抑制HBV-DNA(IC50=4.17±1.70 ) μg·mL-1的复制，还能抑制HBV抗原〔HBsAgEC50=(3.94±1.52)μg·mL-1 HBeAgEC50=(2.46±0.38)μg·mL-1〕的表达。

因此，PA至少有两个作用靶点，其具体的作用机制还有待进一步确证。

11.7 黄酮类化合物汉黄芩素
汉黄芩素(Wogonin)是从中国传统中药黄芩根中分离出的一种成分。

最初的药理研究主要集中在汉黄芩素的抗炎、抗肿瘤活性上。

Guo[20]等重点研究了汉黄芩素在体外和体内的抗HBV活性，发现其显著抑制鸭乙型肝炎病毒(DHBV)DNA聚合酶(IC50=0.57 μg·mL-1)的活性。

经HepG2.2.15细胞株检测，汉黄芩素能有效抑制HBV抗原的分泌(HBsAgIC50=4 μg·mL-1，HBeAgIC50=4 μg·mL-1)及HBV-DNA(ED50=5 mg·kg-1)的复制。

12 结语
免疫调节剂的副作用和核苷类似物耐药性病毒株的出现，使慢性乙型肝炎的临床治疗急需作用机制新颖的抗HBV药物。

抗HBV非核苷类药物的研究开辟了抗乙型肝炎药物研究的新领域、新思路，拓宽了联合用药的选择范围，为征服慢性乙型肝炎带来了新的希望。

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