电镜技术 9.15

Figure 11 G-6-Pase reaction products decreased markedly after 3 d of cadium treatment. ×20 000
Figure 12 Showing intense G-6-Pase reaction products of Leydig cell after 3 d of cadium add zinc treatment. ×20 000
（二）取材的要点是 1、快： 1min 2、小： 1mm3 3、利 4、净 5、冷： 4℃ 6、准 7、部位一致 8、做好标记
青霉素小瓶，固定液，手术 器械（剪刀、镊子等）、双 面刀片、牙科蜡板（或硬纸 片）、装有冰袋的保温桶、 标签纸、铅笔、牙签 手术器械，双面刀片都需 要干净，用酒精去除油脂， 固定液、手术器械、双面 刀片要预冷
电镜生物样品制备技术
重庆医科大学生命科学院 许舸

样品制备是电镜技术中一个重要的组成部 分，是电镜工作中最繁重的环节。要学习 掌握好细胞超微结构知识及应用电镜技术 进行研究工作，都必须首先了解电镜的标 本制备技术。
透射电镜样品制备 常规 特殊 扫描电镜样品制备 常规 特殊
第一部分 常规透射电镜样品制备技术
1、常用免疫电镜方法的原理
PAP法（peroxidase-antiperoxidase） 又称可溶性酶--抗酶法。特点为参加反应的抗体都不被酶直接标记。步骤：① 第一抗体（Ab1）与组织中特异性抗原（Ag）相结合形成抗原抗体（Ag－Ab1）复 合物；②用第二抗体（Ab2）的一个Fab段与第一抗体结合，另一个Fab段游离，形 成抗原--第一抗体--第二抗体（Ag-Ab1-Ab2）复合物；③用过氧化物酶--抗过氧化 物酶复合物（PAP，与Ab1同种动物的血清）与第二抗体的游离Fab段结合，形成 Ag-Ab1-Ab2－PAP复合物；④用过氧化氢和二氨基联苯胺（DAB）使PAP的过氧化 物酶形成不溶的、暗棕色的嗜锇化合物。 优点： ①保存抗体活性好；②PAP复合物稳定；③敏感性高，比间接免疫荧 光抗体法敏感性高100～1000倍；④由于敏感性高,节约了抗体用量,也减少了非特 异性背景染色。 缺点：①反应产物颗粒较大，遮盖背景；②DAB有致癌作用，操作中需格外 小心；③内源性氧化酶对此法有干扰。
一、取材
实验动物取材与临床活检取材的区别
二、固定
（一）固定的目的：利用化学或物理方法，使组织尽可能保存接近生命
状态的结构。固定细胞内的各种成分，避免死后自身酶分解出现自溶， 或外界微生物的侵入繁殖导致细胞的超微结构受到破坏。
（二）固定方法：化学固定和物理固定

能够固定细胞、组织结构的化学试剂称为固定剂。固定剂能和细胞内 的大分子物质，主要是蛋白质发生化学结合形成交联，使蛋白成分得 以凝固，同时也能保存糖类和脂肪，使其保持生活时的状态和位臵，

2、体内原位固定法：多用于解剖关系比较复杂或对缺氧
比较敏感的组织。 3、灌流固定法：适用于取材困难的柔软组织，或难以浸 透、死后变化快的组织和器官。如中枢神经系统，视网膜、 肾脏等。可以做动物的全身灌流，或是器官局部灌流。

三、漂洗

目的：除去残留的固定液 方法：缓冲液漂洗3次，10-15min
六、包埋、聚合
2、常用包埋剂

环氧树脂类：
（1）环氧树脂618：粘度大，对温度和湿度要求不 十分严格 （2）Epon812：粘度低，对湿度要求严格
加速剂：DMP-30（2，4，6－三（二甲基氨基甲基苯酚） 固化剂：DDSA（十二烷基琥珀酸酐） MNA（六甲酸酐） 增塑剂：DBP（苯二甲酸二丁酯）
六、包埋、聚合
初级反应：底物被磷酸水解酶作用后分解产生磷酸。 底物 磷酸水解酶 H3PO4 最终反应：磷酸与金属捕捉剂结合形成反应产物。 H3PO4 捕捉剂（如Pb2+） Pb3(PO4)2↓ 最终反应产物为电子致密的沉淀物，电镜下易于观察并显示出酶的定 位。近年来常用铈（ Ce3+）作为捕捉剂。
二、电镜细胞化学技术
从而达到把细胞的精细结构保存下来的目的。
二、固定
（三）理想固定剂和良好的固定标准 1、理想固定剂应具备的条件： 穿透力强，不产生变形 能够稳定细胞的结构和化学成分 将细胞内的成分变为不溶状态 使细胞内酶的活性和其它大分子物质的活性功能基团得以保存 能够增强图像的反差 2、良好的固定标准： 细胞的膜系结构线条清晰，连续而不断裂，细胞基质充满密度 均匀的精细颗粒，不见明显的空白区和颗粒聚集现象。细胞核 结构层次清晰，无染色质不规则的聚集和异常的空白区。

戊二醛（glutaraldehyde，C5H8O2）；
不能单独作为电镜样品固定液，对脂肪的保护作用差。没有“电子 染色”的作用，通常用于前固定。

甲醛（formaldehyde）
电镜多用多聚甲醛，对酶活性保存好，可与戊二醛混合或单独用于 细胞化学灌流固定或作为前固定液
二、固定
（六）固定方法

1、浸泡固定法：适用于大多数样品。先用戊二醛做前固 定，锇酸作后固定，称双固定法。

的切割性能以及操作者的技术经验等因素密切相关。

进行超薄切片前，必须做好一切准备工作，如选择和清洗 载网、制备支持膜、制备玻璃刀、修整包埋块等，开始切
片时必须心境平稳，精力集中，避免任何干扰（如随意离
位、各种震动、人员往来、尘粒污染等）。
七、超薄切片术
（一）准备工作 1、载网和支持膜 （1）载网 1）作用：承载样品,以便后续染色和观察 2）种类： 材质：铜网、不锈钢网、金网、镍网、尼龙网、碳网等 形状：直径2-3mm，厚度20-50μm 网孔数目：200-300目 网孔形状：圆形、方形、单孔形、狭孔形等 3）清洗

（三）包埋方法 1、常规包埋 2、定向包埋
六、包埋、聚合
（四）聚合 37℃（16h），45℃（12h），60℃（14h）
七、超薄切片术

超薄切片术是应用超薄切片机制备出供透射电镜观察的超 薄切片的专门技术，它是整个制样程序的中心环节。 超薄切片的好坏与切片机的性能、切片刀的质量、包埋块


切片厚度的选择 灰色 400-500埃 银色 500-700埃 金色 700-900埃 紫色 900埃以上
反差和分辨率均适中
七、超薄切片术
（五）染色


利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使各细 胞结构对电子产生不同程度的散射，以增强明暗之比（反 差）而显示出各种超微结构，故电镜标本的染色称为“电 子染色”。 1、电子密度
五、浸透
（一）目的：用包埋剂臵换出样品中的脱水剂
（二）方法：
1、半浸透： 100%脱水剂和包埋剂1:1混合
2、纯浸透：纯包埋剂
六、包埋、聚合
（一）包埋的目的：让包埋剂完全浸透到组织内部，并在一 定条件下聚合成包埋块，作为细胞结构的支架，有利于制 备出超薄切片。 （二）包埋剂 1、理想的包埋剂应具备的条件 （1）聚合前粘度适中，能较快渗入组织； （2）聚合均匀充分，聚合前后体积变化小，组织无变形， 微细结构保存良好； （3）聚合后有良好的切割性，软硬适度易于调整； （4）能经受电子束轰击，高温下不易升华和变形； （5）高倍下放大不显示包埋剂本身的结构； （6）对人体无害，便于操作。

又称超微结构细胞化学，它借助细胞内的化学反应，
研究细胞内各种成分在超微结构水平上的分布情况， 以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化，以阐明
细胞的结构和功能的关系。广义的电镜细胞化学技术
包括电镜酶细胞化学技术、电镜免疫细胞化学技术、
特异酶消化印证技术、电镜放射自显影、超微示踪技
术、X射线微区分析法等。
二、电镜细胞化学技术
RER,G-6-Pase
Mito., SDH
二、电镜细胞化学技术
（二）电镜免疫细胞化学技术 简称免疫电镜（immunoelectron microscopy）是 将光镜下的免疫组织化学、免疫细胞化学与各种 电镜技术有机地结合起来，在细胞超微结构水平 上研究抗原抗体反应，进行抗原的超微结构水平 定性、鉴别和定位的一种技术。
二、固定
（四）影响固定的因素 固定剂的pH值、渗透压、温度、固定液的浓度、用量、固 定时间等 （五）常用固定剂

四氧化锇（Osmium tetroxide，OsO4）；
又称锇酸，是电镜生物样品使用最广泛的固定剂，兼有电子染色作 用，可作单固定，一般不用于电镜细胞化学实验的固定。对脂类有良 好的固定作用，对糖原和核酸的保护作用差。多用于后固定。
七、超薄切片术
2、常用染色剂 （1）醋酸铀（uranyl acetate） 又称醋酸双氧铀 块染 1-2h或过夜 片染 30min （2）枸橼酸铅（lead citrate） 片染，易被空气中的CO2污染

第二部分 透射电镜特殊样品制备


内容:
负染色技术 电子显微镜细胞化学技术 电镜酶细胞化学技术 电镜免疫细胞化学技术 真空喷镀技术 冷冻蚀刻技术 特殊样品制备
微体
线粒体 细胞膜
过氧化氢酶
细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氨酶 核糖核苷磷酸酶（如ATP酶）、碱性磷酸酶
二、电镜细胞化学技术
Figure 10 G-6-Pase reaction products were rich in Leydig cell of the control group rats. ×20 000
Potential Knife Edge
七、超薄切片术
七、超薄切片术
（二）修块
七、超薄切片术 （三）半薄切片、染色及定位 切片厚度： 0.5-2μm 染色：甲苯胺蓝
七、超薄切片术
（四）超薄切片

装块、装刀、对刀、加水、切片、捞片
七、超薄切片术
七、超薄切片术
七、超薄切片术

二、电镜细胞化学技术
（一）电镜酶细胞化学技术（electron microscopic cytochemistry of enzyme or ultracytochemistry of enzyme）


基本原理和内容 利用酶催化反应特点，从亚微结构上研究酶的分布和活性。按其催化反 应的性质可分为水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶、合成酶和异构 酶六大类，应用较多的有水解酶和氧化还原酶。现以水解酶为例，介绍 此技术的主要过程和基本原理。
七、超薄切片术
（2）支持膜 聚乙烯醇缩甲醛（Formvar）膜和火棉胶膜
七、超薄切片术
2、制刀 （1）种类 玻璃刀、钻石刀
七、超薄切片术
Leabharlann Baidu
（2）玻璃刀制作
七、超薄切片术
锋利的刀口
Tip: For cryoultramicrotomy knives, this shelf should be 0.2mm or less in width (for maximum sharpness of the knives). For room temperature plastic sectioning, the shelf may be 0.5 – 1.0mm wide (for a more robust knife edge).

透射电子显微镜的电子束穿透能力较弱， 大多数标本无法直接在透射电镜下进行观 察，必须切成厚度10-100nm的薄片方可使 用。这种电镜观察的切片比光镜的切片要 薄100倍左右，故称超薄切片（ultrathin section）

超薄切片制备过程示意图
一、取材
（一）取材要求：组织材料新鲜，防止各种原因 引起的离体或脱离正常生活环境后的变化。
四、脱水

目的：使不溶于水的包埋剂能浸透入组织和细胞里 方法：乙醇和丙酮逐级梯度脱水 50％→70％→90％→100％
（块染：70%饱和醋酸铀的乙醇溶液，4℃，1-2h或过夜）
四、脱水
• 注意事项 （1）脱水既要充分，又不能在无水乙醇或丙酮中停 留时间过长。 （2）根据材料的性质和大小，适当增加或者减少脱 水时间。 （3）如果脱水组织需要过夜，可将之臵留于70%脱 水剂中。
二、电镜细胞化学技术

应用 主要用于：（1）酶在超微结构上的定位，（2）标记和鉴定某 些细胞和细胞器，（3）通过显示过氧化物酶，定位示踪HRP, （4）利用免疫酶技术，电镜下显示特异性标记物的定位。
各种细胞器的标志酶
目前应用电镜技术常显示的标志酶有：
细胞器
内质网 高尔基体 溶酶体
标志酶
核苷二磷酸酶，葡萄糖-6-磷酸酶 焦磷酸硫胺素酶（Trans膜囊）、烟酸胺腺嘌呤二核苷磷酸酶（中间膜囊） 酸性磷酸酶


一、负染色技术

利用高密度无结构的重金属物质把生物标本包绕起来。这 种反差是负像（与正染色的超薄切片相比较）。最常用的 染色剂是磷钨酸钠（phosphotungstic acid，PTA），此法 常用于病毒、蛋白分子或细胞亚单位的分子结构研究，制 样简单，可作快速诊断。
二、电镜细胞化学技术