病毒血凝和血凝抑制试验--(以新城疫为例)

实践三 病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）

实践目的：

1．掌握血凝（HA ）和血凝抑制(HI)试验的原理 2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法 实践原理：

某些病毒(如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体（免疫血清）所抑制，即为红细胞凝集抑制试验。 实践内容：

1．红细胞凝集试验(HA 试验) 主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。

鸡新城疫病毒的HA 试验现采用微量法，在V 形微量反应板上进行。 (1)首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴(25μl)。

(2)用微量移液器取病毒抗原液25μl 加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取25μl 液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25μl 液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:2～1:2048，第12孔为红细胞对照。 (3)再以微量移液器每孔加％红细胞悬浮液1滴(25μl)。

(4)在振荡器上振荡混匀约l ～2分钟，再置37℃作用15分钟后观察结果。

(5)每次测定样品都应同时做红细胞对照。

表1 鸡新城疫血凝效价(HA)的测定术式(微量法)

孔号 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

病毒稀释倍数 1:2

1:4

1:8

1:16

1:32

1:64

1:128

1:256

1:512

1:1024 1:2048 对照

生理盐水 25

l 25l μ病毒液

25l

l l l l 25l l l l l l μl 弃去 1％红细胞悬液 25μ

l

25μl

25μl

25μl

25μl

25μl

25μl

25μl

25μl

25μl

25μl

25μl

感作 置振荡器上混匀1～2分钟，放37℃静置15分钟

# 表示100％完全凝集 ++ 表示50％凝集 - 表示不凝集

未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红

细胞被病毒所凝集。

能使100％红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例：病毒液的HA效价为1:128，HI试验时，病毒抗原液25微升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成128/4＝32倍的稀释液。

2.红细胞凝集抑制试验(HI试验) 有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。

(1)用微量移液器每孔各加入1滴稀释液(即25μl)，从第1孔到第10孔。第1l孔加稀释液2滴(50μl)。

(2)以微量移液器取被检血清25μl，放入第1孔，，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使被检血清与稀释液混合均匀，再吸取25μl液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第10孔，最后第十孔吸取25μl液体弃掉；被检血清稀释倍数依为1:2～1:1024，第11孔为红细胞对照，第十二孔为抗原对照。

(3)每孔再加入含有四个单位的病毒液1滴(25μl)至第10孔，第1l孔为红细胞对照孔，不加病毒液；第十二孔为抗原对照，加病毒液。

(4)置振荡器上振荡l～2分钟后，放37℃静置20分钟。

(5)每孔再加入％红细胞悬浮液1滴(25μl)放振荡器上振荡l～2分钟混匀，置37℃，15分钟后判定

结果。

表2 鸡新城疫红细胞凝集抑制(H1)试验(微量法)

孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

被检血清稀释倍数1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:12

8

1:25

6

1:51

2

1:10

24

红细胞

对照

抗原

对照

生理盐水25

l

25μl

被检血清25

l l l l l l l l l l l

弃掉

4单位病毒液25μ

l 25μ

l

25μ

l

25μ

l

25μ

l

25μ

l

25μ

l

25μ

l

25μ

l

25μ

l

25μ

l

振荡器上振荡1～2分钟，放37℃作用20分钟

1%红细胞悬液25μ

l 25μ

l

25μ

l

25μ

l

25μ

l

25μ

l

25μ

l

25μ

l

25μ

l

25μ

l

25μ

l

25μ

l

振荡器上振荡1～2分钟，放137℃作用15分钟

结果例示-------++##-#注：- 表示不凝集、++ 表示部分凝集、# 表示完全凝集。