实时定量PCR课件

Ct值
半对数图谱 27
Ct值的重现性
28
3. Ct值
Ct值与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越 多，达到阈值所需的循环数就越少，Ct值也就越小， 反之亦然。
正常的Ct值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实 验数据的精度。
29
30
Ct值定量的数学原理
×
31
Ct值定量的数学原理
纯度：OD260/OD280=1.8 ~ 2.0 反转录：20 uL的反应体系最多可以将0.4 mg 总RNA反转录成
cDNA； cDNA用量：1 ~ 100 ng RNA反转录所得cDNA加1uL/rxn
58
样品准备－DNA
DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 ~2.0之间 DNA用量：0.05 ng ~ 100 ng
14
染料法的优缺点
缺点
SYBR Green I方法对PCR扩增特异性要求较高
SYBR Green I 可与所有的双链 DNA 相结合，因此由引物二 聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定 量的精确性
SYBR Green I 不能区分不同扩增片段发出的荧光而导 致它不能用于多重反应
荧光染料：EB（溴乙锭） PCR仪：改良的热循环仪 激发光：UV射线 检测器：CCD相机 缺点：仪器耗费巨大；非特异产物导致定量不准确
4
发展简史
1995年美国PE公司成功开发TaqMan技术 1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统 优点：
操作简单、快速方便、灵敏度高、重复 性好、污染率低等
24.5
18S RNA 标准化的 ave Ct Cyp6B6 △Ct
12.3
10.5
12.6
11.9
校正 △△Ct -1.4
0
因此，处理组Cyp6B6基因的表达量是对照组的
2-△△Ct = 2-（-1.4）＝21.4＝2.64倍
53
△△Ct法
优点：优化的体系建立后，每次实验中无需再对看家 基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别 进行PCR扩增即可。
那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况。
应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量 方法之一。
51
△△Ct法
△Ct，即Ct的变化值 假定目的基因和参照基因的扩增效率相同，均为
100%
＝2-(△Ct1- △Ct2) ＝2-△△Ct
52
△△Ct法－举例
处理组 对照组
Cyp6B6 ave Ct 22.8
探针法的优缺点
优点： Tagman探针法中，除引物外，还使用了一条特异的探
针，因此此方法可以特异的检测目标序列，防止非特 异产物的干扰影响定量的准确性 可用于多重反应，即可同时检测多个目的基因。 缺点： 但探针设计成本较高，有时探针设计困难。
20
百度文库、几个概念
21
1.扩增曲线
描述PCR动态进程的曲线称为扩增曲线。 PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而
是呈S型曲线
Fluoresces
Cycles
22
1.扩增曲线
扩增曲线分三个阶段：
荧光背景信号阶段(基线期)：扩增的荧光信号被荧光背景信
号所掩盖，无法判断产物量的变化。
荧光信号指数扩增阶段（对数期），PCR产物量的对数值
与起始模板量之间存在线性关系，可选择该阶段进行定量分析。
在平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量
15.00 3
4
5
6
log(copies)
扩增效率（E）计算
E=10-1/斜率
=10-1/-3.18
=2.06
E%=(2.06-1) ×100%
7
=106%
46
绝对定量举例
如未知样本Ct为20.5，将Ct 值带入线性方程：
20.5= -3.183 X + 40.211 X=（20.5-40.211）/-3.183
×
32
Ct值定量的数学原理
33
Ct值定量的数学原理
ΔRn
3.00
2.50
2.00
1.50
104 103 102
1.00
Threshold
0.50
0.00 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Cycle
34
靶标基因的定量
35
靶标基因的定量
需要制备标准品 需制作绝对标准曲线
100% EFF 90% EFF 80% EFF 70% EFF
10
20
PCR CYCLE NUMBER
30
55
Pfaffl法－
Pfaffl, M.W. Nucleic Acids Research 2001, 29(9):e45
目标基因和参照基因扩增效率不同，但不同样品间目 标基因和参照基因的扩增效率相同。需计算目标基因 和参照基因扩增效率。
5000
10000
无需标准品， 需制作相对标准曲线
2 1
36
靶标基因的定量
Northern blot
半定量PCR
CYP6B6 Actin
37
三、绝对定量
38
三、绝对定量
39
三、绝对定量
标准品的一些标准： 必需用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩
增效率相同 标准品必需是经过准确定量的（例如，用分光光度计
1. 模板均一性问题：起始的细胞数、细胞的状态、 均一性等
2. RNA制备：RNA纯化得率、均一性等 3. 反转录：反转录的效率等
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内标/内参照
因RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率 不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度可能 不同。因此，在进行基因表达研究中都会用看家基因 （house-keeping gene）对数据进行标准化，以校 正因样品初始浓度不同而造成的差异。
7
ABI 7300 荧光定量PCR仪
ABI：Applied Biosystems Inc.
8
9
检测通道
2004年推出的7300和7500均为第三代产品， 2001推出的7900为第二代产品。
7300：4通道 7500：5通道 均需加Rox染料进行校正
10
两种荧光标记法
1. 染料染色
-SYBR Green I -EB
实时定量PCR Quantitative Real-Time PCR
梁沛
中国农业大学昆虫学系
1
主要内容
基本原理 几个概念 绝对定量 相对定量 常见问题
2
一、基本原理
3
发展简史
1993年，日本Higuchi 等人首次采用动态PCR的方法和 封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，首次提 出了荧光定量PCR技术的概念。
41
三、绝对定量
标准品倍比梯度稀释方法： 10v原液(标准品i) +90v稀释缓冲液，得标准品ii 10v标准品ii+90v稀释缓冲液，得标准品iii 10v标准品iii +90v稀释缓冲液，得标准品iv 10v标准品iv +90v稀释缓冲液，得标准品v
Why?
42
三、绝对定量
拷贝数的计算(以dsDNA为例）
要求：标准曲线斜率差值<0.1 缺点：假定扩增效率为100 %；假定标准曲线及每次
扩增之间的效率都保持一致；实验条件优化复杂。
54
AMOUNT OF DNA
Effects of Efficiency
10,000,000,000 1,000,000,000 100,000,000 10,000,000 1,000,000 100,000 10,000 1,000 100 10 1 0
Ct 2 28.64 25.14 22.46 18.92 －
Meant Ct STD 28.41 0.16 25.19 0.04 22.28 0.12 18.77 0.10
45
绝对定量举例
Ct
30.00
27.00
24.00
21.00 18.00
y = -3.183x + 40.211 R2 = 0.9988
2. 探针标记
-Taqman -Taqman MGB -分子信标
11
1. 荧光染料法
SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射 波长最大约为520nm
12
化学原理
13
染料法的优缺点
优点：
实验设计简单，仅需要设计一对上下游引物，不需要 设计探针，通用性好；
成本低； 可通过溶解曲线分析检验扩增产物的特异性。 低通量实验一般优先考虑使用SYBR Green I染料法。
常用的看家基因有：GAPDH、Beta-actin、18S rRNA等
49
相对定量的方法
双标准曲线法 △△Ct法
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双标准曲线法
相对表达量＝
处理组目的基因表达量 处理组参照基因表达量
对照组目的基因表达量 对照组参照基因表达量
优点：分析简单，实验优化简单。
缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线；必 需有固定的标准品做标准曲线；这些标准品并不代表样品 扩增的真实状态比如标准品为质粒或纯化的PCR产物，而待测样品为cDNA，
Ratio＝
Etarget△Ct(control-sample) Ereference△Ct(control-sample)
E=10-1/斜率
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SYBR法常见问题及注意事项
实验流程
样品准备 RT
建立反应体系 上机
数据分析
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样品准备－RNA
提取RNA所用不同处理组的虫量一致，且具有代表性 所有操作尽可能一致 保证无RNase的环境 利用分光光度法确定所提核酸的质量和浓度：
待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×50×稀释倍数 样本分子量=碱基数×660 dalton/bp 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本质量/样本
分子量×6×1014
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三、绝对定量
拷贝数的计算举例：
3000 碱基质粒，浓度100 ng/ul MW= 3000 bp x 660 dalton/bp =1.98 x 106
daltons。 copy数＝ ---1--0-0--n-g-----×6×1014 ＝ 3x 1010 copies/ul
1.98 x 106
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绝对定量举例
棉铃虫Cyp6B2基因拷贝数检测
Copies/ul Ct 1 5×103 28.18 5×104 25.25 5×105 22.11 5×106 18.63 Blank －
与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不 能计算出起始DNA拷贝数。
23
2.荧光阈值
一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号 （baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照 的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。
是人为设定的一个值，可设在指数扩增阶段任意位置上。 缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
（自动）。
24
2.荧光阈值
25
2.荧光阈值
手动设置，原则：大于样本的荧光背景值和阴性对照 的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶 段，真正的信号是超过域值的荧光信号。
26
3. Ct值
Cycle threshold，就是当扩增产物的荧光信号达到设定 的阈值时所经过的循环次数。
Ct值
线性图谱
15
2. 荧光探针法(Taqman)
16
Taqman Probe
Reporter
Quencher
17
Tagman probe 的工作原理
18
探针与PCR产物的数量关系
每产生一个新的DNA片段，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位的荧光信号 信号强度与DNA的copy数成正比
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=6.19 未知样本拷贝数=106.19
=1548816 copies/ul
Ct
30.00
27.00
24.00
21.00 18.00
y = -3.183x + 40.211 R2 = 0.9988
15.00
3
4
5
6
7
log(copies)
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四、相对定量
无需知道目的基因的绝对拷贝数 需要注意的问题：
定量） 标准品必需是标准化的（例如，同一化的细胞数） 在每组实验时，标准品和待测样品必需用相同的阈值
来确定Ct值
40
三、绝对定量
标准品的制备方法： 1.化学合成目的基因，优点是纯度高、定量准确
缺点是受化学合成工艺限制，只能合成120bp以下的 长度； 2.回收纯化PCR产物后克隆到载体上，然后抽提质粒， 经过测量浓度和拷贝数的换算，可准确定量 优点是稳定、准确。
5
实时定量PCR的概念
实时定量PCR技术（real-time quantitative PCR）
是指在PCR反应体系中加入荧光染料，实时监测整个PCR过程中荧 光信号的累积强度，并利用特定数学原理对未知模板进行定量分析的 方法。
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RT-PCR：Reverse-transcription PCR qRT-PCR: quantitative Real-time PCR