第四章 高效液相色谱法

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全多孔填料
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三、色谱柱的装填方法
• 干法:用于粒径大于20m的填料。 • 湿法:用于粒径小于20m的填料, 也叫匀浆法。
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四、色谱柱的性能评价
评价不同色谱柱所用的测试物质
柱类型 测试物质 流动相
吸附柱
反相柱 氰基柱 氨基柱 醚基柱
苯、萘、联苯
苯、萘、联苯
(mm) (cm)
常规 2-5 快速 2-5
10-25 5-10 3-5 3 1-3
0.5-2 2-5
小于10 小于3
微径 0.5-1 10-30
0.1-1 小于1
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一、色谱柱的结构
为了能够耐高压、 耐腐蚀,色谱柱 一般采用优质不 锈钢制成。 柱接 头和连接管既要 耐腐蚀,又要死 体积小。
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• 气动泵 • 往复柱塞泵由液缸、柱塞、单向阀、驱动 器组成 色谱柱
活塞
偏心轮
偏心轮
密封环
储液器
往 复 单向阀 柱 塞 泵
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3、进样系统
• 六通阀定量管。它的优点是进样量可变范 围大,进样量大,重复性高,分析和制备 通用。 • 自动进样器
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手动进样器
样品定量管
– 容易得到;毒性小,使用安全;
– 对分离的样品有一定溶解能力。
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1. 流动相的特性
(1)液相色谱的流动相又称:淋洗液,洗脱剂
;流动相组成改变,极性改变,可显著改变组分分
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吸附色谱
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硅胶的表面特征
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二、液-液分配色谱
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三、化学键合固定相
• 通过有机硅烷与硅胶表面的化学反应,形 成了Si-O-Si-C键,它对溶剂、热具有相 当的稳定性。化学键合固定相有以下三大 优越性。 1.减少了表面活性作用点。 2.耐溶剂冲洗。 3.表面改性灵活,易得重复性的产品。
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苯乙烯-二乙烯苯高分子基质(小球)及疏 水固定相。
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Phenyl-hydrophobic SP PEG-hydrophobic SP
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第五节
液相色谱流动相
mobile phase of LC
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• 理想的流动相:
– 粘度低,沸点适宜;
– 适合于所用检测器; – 纯净,有一定惰性;
Absorbance
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2)荧光检测器(fluorescence detector) 特点: 极高灵敏度; 高选择性; 线性范围宽(但比
紫外检测器窄);
受外界影响小; 适用于梯度洗脱。
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• 应用:生化物质包括某些代谢产物、农药、
多环芳烃,维生素、黄曲霉素、卟啉类化合
物、氨基酸、胺类、甾族化合物等都有荧光, 可用该检测器进行检测; • 荧光检测器的光源通常为氙灯,它可以在 250-600 nm的范围内发出连续光谱。
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3)示差折光检测器
(differential refractive index detector)
可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差 值。差值与浓度呈正比;
通用型检测器(物质具
有不同的折光指数);
灵敏度低、对温度敏感 、不能用于梯度洗脱。
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R=Z(n-n0) 溶液的折射率等于溶剂和溶质各自摩尔浓度之和 n=C0n0+Cini Ci是溶质的摩尔百分数,C0是溶剂的摩尔百分数 ni为溶质的折射率。因为C0+Ci =1 有n=(1-Ci)n0+Cini=n0+Ci(ni-n0) n-n0=Ci(ni-n0) R=Z Ci(ni-n0)检测灵敏度较低
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检测器使用统计
43.0%
UV-VIS DAD Fluorescence Refractive Index 22.0% 4.0% Electrochemical 1.0% 5.0% 7.0% 10.0% 8.0% Conductivity Mass spec Others
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高效色谱柱、高压输液泵、高灵敏度检测
器的应用。
70年代,微处理机的使用进一步提高了仪
器的自动化水平和精度。
80年代全自动色谱仪。
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二、液相色谱仪的基本组成
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仪器组成:
现代液相色谱仪主要分为分析、制备、 专用三种类型。
主要由输液系统、进样系统、柱分离系 统、检测和记录系统组成,包括溶剂贮 液器、高压泵、进样器、色谱分离柱、 检测器、记录仪等主要部件,还有梯度、 温度控制器、自动进样器、数据处理装 置等。 Page 11
己烷
甲醇/水(8:2)
甲苯、苯乙睛、苯乙酮己烷/异丙醇(98:2) 联苯、硝基苯 邻间对硝基苯胺 庚烷 己烷/二氯甲烷/异丙醇
(70:30:5)
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第三节 检测器
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1)紫外检测器
应用最广,对大部分有机化合物有响应。
特点: 灵敏度高; 噪音低、线形范围宽,基线稳定; 流通池可做的很小(1×10 mm ,容积 8 μL); 对流动相流速和温度变化不敏感;可用于梯度洗脱。 波长可选,易于操作;重现性好;
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4) 电化学检测器
高灵敏度检测器,线性范围通常有4-5
个数量级。 有电导、电势、电流三种形式。 电导记录的是柱后流出物的电导变化 电流的检测原理是当电活性物质流经电 极表面时,在电极表面发生氧化还原反 应,产生电流,经放大后检测记录,得 到色谱图。电极表面的电子转移所产生 的电流符合法拉第定律。
后视图 前视图
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六通阀之装样
泵 1 定 量 环 6 废液 2 3 色谱柱
5
排空
4
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六通阀之进样

1
定 量 环 6 废液
2 3 色谱柱
5
排空
4
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第二节 液相色谱柱
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• 现代液相色谱柱分为常规、快速、微径柱 等,其主要参数如下。
柱类型 管内径 柱长 填料粒径 流速 检测池体积 (um) (ml/min) (ul)
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一、 液固吸附色谱固定相
• 极性吸附剂:硅胶、氧化铝、分子筛、聚 酰胺等。极性吸附剂可进一步分为酸性吸 附剂和碱性吸附剂。 酸性吸附剂包括硅胶、硅酸镁,适合于 分析碱性物质如胺。 碱性吸附剂包括氧化铝、氧化镁、聚酰 胺等。适合于分析酸性物质如酚、羧酸、 吡咯衍生物。 • 非极性吸附剂:活性炭。
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键合固定相类型: 1.Si-O-C键型(硅胶与醇类物质反应) 2.Si-N键型(硅胶与胺类物质反应)
3.Si-C键型(硅胶与卤代烷反应)
4.Si-O-Si-C键型(硅胶与有机硅烷反应)
它是目前的主导键合类型,具有良好的化 学稳定性,可在pH2-8的介质中使用。
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表面多孔型填料
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2.全多孔填料 包括球形和无定形,直径在3-10m,比 表 面 积 为 60-600m2/g , 孔 体 积 在 0.22ml/g之间。改善了固定相和停滞流动相 的传质速率,提高了柱效。小颗粒粒径 对提高柱效非常有利,但是柱压也会急 剧增加,因此要在较低的柱压下操作必 须减小柱长度。此时也可提高分析速度。
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二、色谱柱填料的一般特性
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1.表面多孔型(薄壳型)填料
表面多孔型或薄壳型填料是为现代液相色谱设 计的第一种优质填料,多用在20世纪60、70年代。 其中心是一个惰性的硬核,在核的表面包敷一层 很薄的多孔物质,如硅胶、氧化铝、聚酰胺、离 子交换树脂等,也可以是键合固定相。它的粒径 通常在20-40m,比表面积在1-15m2/g,孔径在 100-500埃之间。其机械强度高、渗透性好、传质 速度快,柱效较高。
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三电极安培检测器的剖面结构图 1.工作电极 2.辅助电极 3.参比电极 4.色谱柱流出液入口 5.出口
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化学发光检测器
化学发光检测系统 1.试剂 2.流动相 3.泵 4.阻尼器 5.进样器 6.柱 7.混合反应8.流通池 9.光电倍增管 10.记录仪 11.混合器 12.滤光片 13.废液
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• 使用:选用无紫外吸收的溶剂作流动相,
用于有紫外吸收的物质的检测。
• 分类:按光路系统分有单、双光路两种, 按波长分有固定和可变波长两种。
• 常用固定波长:214 nm、230 nm、254nm、
280 nm。
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紫外检测器样品池 检测池的体积和构型直接影响柱效和灵敏 度。标准的池体积为5-8l,光程5-10 mm。 常用的流通池的形状为Z和H形 。
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• 对具体的分离对象能建立合适的分离模式,
难点与重点
•重点:各种分离模式的分离原理。 固定相与流动相。 四种常用检测器。
•难点:离子对色谱法与手性色谱法。
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第一节 概 述
outline
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一、高效液相色谱法发展简史
始于20世纪60年代,在经典液相色谱基础
上引入GC理论和技术。
光 光
流动相
流动相
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2)光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展;
光电二极管阵列检测器:1024个二极管阵列,各自检测
特定的波长,计算机快速处理,三维立体谱图,如图所示。
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定性分析--探索三维立体影像
Spectral Acquisition Modes All spectra Every 2nd spectrum All in peak Apex+Slopes+Baselines Apex+Baselines None
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2、输液系统(耐酸不锈钢)
耐腐蚀:适合于各种溶剂、缓冲溶液。 高压下可连续工作:耐压40-50MPa/cm2 ,连续 工作24h。 流量范围广:分析型的在0.1-10ml/min;制备 型的在1-100 ml/min。 流量稳定:流量重复性和精度在0.5%左右。 其他:密封性好,泵室体积小,便于清洗,便 于实现梯度洗脱。
Si
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四、 其它基质材料的HPLC固定相
现在70%以上的固定相基质是硅胶,由于其 耐酸碱性较差,加上它与蛋白质分子间的 兼容性较差,所以就有不同基质的固定相 出现。有机高分子小球是常用的一种,它 有以下优点:(1)易进行化学处理(2) 负荷能力强,有较高的色谱容量(3)良好 的化学稳定性,pH范围宽(4)不易产生不 可逆吸附,对生化物质的适用性强等。
蒸发光散射检测器
蒸发光散射检测器工作原理图 1.溶剂流 2.喷雾气 3.雾化器 4.蒸发器 5.光阱 6.光源 7.排气口
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第四节
HPLC固定相
固定相也叫填料和吸附剂,多孔无定形硅 胶是液相色谱的经典填料。20世纪60年代 中后期,发展了薄壳形填料,1972年以后, 出现的多孔微球硅胶,小粒径减小了涡流 效应,缩短了组分在两相间的传质扩散过 程,从而提高了色谱柱的分离效率。HPLC 固定相主要以液固吸附、键合相和液液分 配三种类型为主。
Chapter4 高效液相色谱法
High performance liquid chromatography
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本章内容简介
• HPLC系统组成 • HPLC固定相与流动相 • 各种分离模式 • 常用检测器 • 色谱条件的优化 • 在药学中的应用
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学习目标
• 明确几个概念: 正相色谱、反相色谱、键合相色谱、离子 对色谱、手性色谱等。 根据分析结果,通过改变流动相的组成和 配比优化分离条件。
1.自动进样器 3.输液泵 5.检测器
2.流动相储瓶 4.色谱柱 6.回收瓶
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1
1、溶剂贮存器及溶剂脱气
溶剂贮存器通常用不锈钢、 玻璃或聚四氟塑料制成, 体积为0.5-2升。 常用的脱气方法有
抽真空法、吹氦法、
超声波脱气法等。
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Aglient 1100高效液相色谱仪在线脱气结构示意图 1.高压输液泵 2.储液瓶 3.膜过滤器 4.塑料膜管线 5.传感器 6.控制电路 7.电磁阀 8.真空泵 9.脱气后流动相至过滤器 10.脱气单元
Typical Column Packing Supports
OH Si O Silica Gel Surface
OH O Si O
OH Si Si O O O Si OH
Chemically Modified Silica Gel Pores Si Si Si Si
CH 3 Si - O - Si - (CH2)17CH3 CH 3
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