蛋白激酶检测方法
激酶活性测定方法
激酶活性测定方法
激酶活性测定方法是用来测量生物体内激酶酶活性的实验方法。
激酶是一种能够催化底物分子转化为产物的酶，通常通过磷酸化底物来进行催化反应。
常见的激酶活性测定方法包括：
1. 放射性测定：将激酶反应体系中的底物标记上放射性同位素，通过测量反应产生的放射性底物酶解产物，来确定激酶的活性。
2. 荧光测定：利用荧光标记的底物，通过测量反应产生的荧光强度变化来测定激酶的活性。
常见的方法有荧光共振能量转移（FRET）和荧光极化。
3. 酶促颜色反应：将激酶反应体系中的底物溶液与某种荧光标记的酶结合，通过测量荧光强度的变化来测定激酶活性。
4. 无标记测定：利用质谱等无标记技术，通过测量激酶反应产物与底物的质量比，来确定激酶的活性。
需要注意的是，选择合适的激酶活性测定方法需要考虑到底物特性、实验操作的可行性和灵敏度等因素，并且需要与其他实验数据进行比较与分析，从而得出准确可靠的结果。
小鼠蛋白激酶 G（PKG）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书
小鼠蛋白激酶G（PKG）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆、组织等样本中蛋白激酶G（PKG）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠蛋白激酶G（PKG）水平。
用纯化的小鼠蛋白激酶G（PKG）捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入小鼠蛋白激酶G（PKG），再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的小鼠蛋白激酶G（PKG）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠蛋白激酶G（PKG）含量。
试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
热点实验：PKC蛋白激酶活性检测实验
实验试剂：琼脂糖（Promega公司，V3125）；其他常备试剂购自sigma公司；PKC活性检测试剂盒（Promega公司， V5330）实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8）基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC活化度）。
操作步骤：1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。
2．在4℃，用14,000 × g 离心裂解液5 分钟，保存上清。
3．用PKC 抽提液预平衡1ml 的DEAE 纤维素柱，再把第2 步中得到的上清过柱。
用5ml的PKC 抽提液洗柱子，然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脱含有PKC 的组分。
4．用PKC 稀释液（PKC dilution buffer）将少量蛋白激酶C（Promtein Kinase C）稀释到2.5ug/ml。
随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。
5．用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30 秒，或直到溶液变温暖。
6．对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml 小离心管中混合PepTag® PKC 5×Buffer,PepTag® C1 Peptide，超声过的PKC Activator 5X Solution，和水。
在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。
阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值（说明书第IV.部分）。
标准PKC检测PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5X Solution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ul样品 9ul去离子水使终体积为 25ulPKC阳性对照检测PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ulProtein Kinase C (2.5ug/ml 溶于 PKC dilution buffer） 4ul去离子水使终体积为 25ulPKC阴性对照检测（不加PKC）PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ul去离子水使终体积为 25ul（以阳性对照IOD值为100，其余各组的PKC+ p-PKC总和为100分配IOD数值）。
酪氨酸蛋白激酶活性的检查
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新 技术
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酪氨酸 蛋 白激酶活性的检 查
北 京 医 院 老 年 医 学研 究 所
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蛋白激酶检测方法
1.RT-PCR 测定PKCαmRNA 表达用TRIZOL 一步提取法提取总RNA ,按Ivit rogen 公司Super Script First-st rand Synthesis For RT-PCR 步骤进行逆转录。
以β-actin 作为内参照。
引物序列, PKCα上游为5′-TGCTGACTTTGGGATGTG-3′, 下游为5′- TGTTTGT2TCTCGCTGGTG-3′,扩增产物长度605 bp ;β-actin 上游为5′- TGACTTA GTTGCGTTACACCC-3′,下游为5′- CGAAG2GCTCATCATTCAAAA-3′,扩增产物长度450 bp 。
RT 反应条件: 50 ℃ 30 min ,99 ℃ 5 min ,5 ℃5 min 一个循环。
PCR 反应条件: 94 ℃预变性2 min ,然后按照94 ℃ 30 s ,55 ℃30 s ,72 ℃ 1 min 进行30 个循环, 最后72 ℃延伸10 min。
2. Western blot 检测PKCα蛋白表达（1）胞质、胞膜蛋白的提取:所有实验操作均在4 ℃下进行。
各样品取50 mg ,加入5 倍于湿重的粉碎缓冲液,剪碎、匀浆,4 ℃12 000 r/ min 条件下离心2 h ,上清液即为胞质蛋白。
将上述沉淀用2 ml 胞膜蛋白提取液悬起,超声粉碎后抽提30 min ,再于4 ℃12 000 r/ min 离心2 h ,上清即为胞膜蛋白。
将蛋白定量后,调定至等蛋白浓度备用。
（2）PKCα分析:取20μg 蛋白与等体积样品缓冲液混合,煮沸5 min ,十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶( SDS-PAGE)电泳,电转移至硝酸纤维素膜上, 5 %脱脂奶粉封闭3 h ,0. 1 % TTBS 清洗,加入PKCα 抗体、室温孵育过夜, 再用TTBS 清洗,以碱性磷酸酶标记的二抗室温孵育l h , TTBS清洗,与偶联辣根过氧化物酶的第二抗体( sigma) 反应,Western blot 增强化学发光法( ECL) 发光试剂显色并拍照。
激酶抑制剂测试-检测方法详细介绍
4E-BP1可被专一性的抗磷酸化4E-BP1的抗体识别，并结合标记了辣根过氧化素酶的抗抗
汉 体，随后加入化学发光试剂并检测发光强度，以发光强度的大小反映酶活的高低。 ELISA法的优点是定量准确，信号值可以通过二级抗体或者亲和素-生物素系统放大，
Adapta™。其中ADP Hunter™可以利用激酶反应中产生的ADP，将烯醇式丙酮酸 (phosphoenolpyruvate, PEP)转化为丙酮酸(pyruvate)，并最终转化为荧光信号。该方法可以 实时监测激酶的活性变化。而Transcreener™和Adapta™则是在ADP的特异性单克隆抗体上 标记铕(Eu)原子，同时再使用d2或者AlexaFluour647等荧光分子标记的ADP来竞争激酶反应 的产物ADP，用于检测ADP的生成量。 3.2.3 检测ADP生成量的方法的优缺点
2.4 核磁共振波谱法(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)
NMR的原理是用无线电波(60 cm~300 m)照射分子时，原子核自旋能级的跃迁，由于局 部抗磁屏蔽效应的存在，不同化学环境的原子核所吸收的频率不同，从而产生不同的化学
武 位移。常见的NMR有氢谱、碳谱、氮谱等等。氢谱主要研究氢分布，碳谱研究碳骨架的信
两类。
汉 1.1 膜过滤方法 在该方法中，激酶反应使得多肽产物被32P -ATP或者33P -ATP标记。该产物会结合在过
合 滤膜上，而其他游离的放射性同位素则会被磷酸盐洗脱，从而不会干扰实际检测。其主要
优势在于可以应用于激酶和多肽底物的检测上而不受其他条件的限制。该方法不需要对多
蛋白酶活性测定方法
2.0.4M碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g用水溶解和定容至1，000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。
3.0.1M三氯醋酸（TCA）：用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1，000ml。
4.L—酪氨酸。
5.缓冲液：磷酸二氢钙—氢氧化钠缓冲液。
A：0.2mol/L KH2PO4 (ml): 50;
1.5操作步骤
将酪蛋白溶液放入30℃恒温水浴中预热5min，取1ml酶液注入试管中，按以下程序操作。
酶液1ml——————————————在30℃恒温水浴中预热1—2min
+
2%酪蛋白1ml——————————加入时立即记时，精确反应10min
+
0.4MTCA 2ml—————————立即摇匀，终止反应。
将各管剧烈混合并在30℃保持30min，以完全沉淀反应后过量的酪蛋白。
从水浴中取出静止10min过滤（11cm的whatman43#滤纸）
+
滤液1ml
+
0.4Байду номын сангаасNa2CO35ml
+
稀释福林试剂1ml
摇匀，30℃恒温水浴显色20分钟
测定OD值————————用720型分光光
度计测定（波长680nm）
空白试验：酶液1ml，先向其中加入三氯醋酸，然后加酪蛋白溶液。其余步骤同试验。
B：0.2mol/L NaOH(ml) 29.63
C：水（ml）120.37
PH（20℃）：7.0
6．酪蛋白溶液：精确称取酪素2.000g，先用少量0.5N氢氧化钠浸润后，加入少量缓冲液，在沸水浴中加热，经常但不要剧烈的搅拌使之完全溶解，冷却后移入100ml容量瓶中，并用相应的缓冲液定容到刻度。若定容时泡沫过多，可加入1~2滴乙醇消泡。酪蛋白溶液可在4℃保存一周，变质后不能使用。
热点实验：PKC蛋白激酶活性检测实验
实验试剂：琼脂糖（Promega公司，V3125）；其他常备试剂购自sigma公司；PKC活性检测试剂盒（Promega公司， V5330）实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8）基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC活化度）。
操作步骤：1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。
2．在4℃，用14,000 × g 离心裂解液5 分钟，保存上清。
3．用PKC 抽提液预平衡1ml 的DEAE 纤维素柱，再把第2 步中得到的上清过柱。
用5ml的PKC 抽提液洗柱子，然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脱含有PKC 的组分。
4．用PKC 稀释液（PKC dilution buffer）将少量蛋白激酶C（Promtein Kinase C）稀释到2.5ug/ml。
随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。
5．用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30 秒，或直到溶液变温暖。
6．对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml 小离心管中混合PepTag® PKC 5×Buffer,PepTag® C1 Peptide，超声过的PKC Activator 5X Solution，和水。
在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。
阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值（说明书第IV.部分）。
标准PKC检测PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5X Solution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ul样品 9ul去离子水使终体积为 25ulPKC阳性对照检测PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ulProtein Kinase C (2.5ug/ml 溶于 PKC dilution buffer） 4ul去离子水使终体积为 25ulPKC阴性对照检测（不加PKC）PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ul去离子水使终体积为 25ul（以阳性对照IOD值为100，其余各组的PKC+ p-PKC总和为100分配IOD数值）。
kinase-glo -回复
kinase-glo -回复什么是kinaseglo？如何使用kinaseglo测定蛋白激酶活性？kinaseglo是一种用于测定蛋白激酶活性的试剂盒。
蛋白激酶是一类能够催化蛋白质磷酸化反应的酶。
蛋白磷酸化在细胞信号传导过程中起到重要的调节作用，因此蛋白激酶活性的测定对于研究细胞信号传导、药物筛选等具有重要意义。
使用kinaseglo测定蛋白激酶活性的过程可以分为以下几步。
第一步：准备样品和试剂在开始实验之前，首先需要准备好实验所需的样品和试剂。
样品可以是纯化的蛋白激酶，也可以是细胞提取物等含有蛋白激酶的复杂混合物。
试剂一般包括kinaseglo试剂盒中提供的试剂以及可能需要的其他辅助试剂。
根据实验需要，可能需要调整试剂的浓度和体积。
第二步：测定蛋白激酶活性首先，将合适的底物（例如ATP和底物蛋白）与蛋白激酶样品和试剂混合，形成反应混合物。
通常情况下，反应混合物中蛋白激酶的浓度应该在适宜的范围内，以确保测定结果的准确性。
然后，将反应混合物孵育在适当的温度和时间下，使蛋白激酶催化底物的磷酸化反应发生。
接下来，加入kinaseglo检测试剂，以停止反应，并释放出ATP酶催化的磷酸化产物。
kinaseglo检测试剂可使释放的磷酸化产物与其底物之间发生化学反应，产生发光信号。
发光信号的强度与蛋白激酶活性成正相关。
第三步：检测和分析在kinaseglo发光试剂添加之后，将反应混合物置于合适的发光仪中，进行发光检测。
根据实验设计和需要，可以选择合适的发光时间和测量模式。
得到发光信号的强度后，可以利用标准曲线进行定量分析，从而确定样品中蛋白激酶的活性。
标准曲线的建立需要利用已知活性的蛋白激酶样品进行测定，并据此绘制出发光信号与蛋白激酶活性之间的关系曲线。
此外，通过对不同条件下的实验组和对照组进行比较分析，还可以进一步研究蛋白激酶的调节机制和药物对其活性的影响。
总结：kinaseglo是一种用于测定蛋白激酶活性的试剂盒，其使用过程包括准备样品和试剂、测定蛋白激酶活性以及检测和分析。
非放射性蛋白激酶
普洛麦格（北京）生物技术有限公司．北京市东城区北三环东路36号．环球贸易中心B 座907－909．1PepTag ® 非放射性蛋白激酶C 或依赖于cAMP 的蛋白激酶检测系统这份说明书的英文原文可以从以下网址下载.请登陆以上网页查看您是否使用的是最新版的说明书。
如果您在使用这个系统时有任何问题，请与Promega 技术支持联系。
邮件：chinatech@I. 描述....................................................................................................1 II. 产品组分和储存条件...............................................................................3 III. PepTag ® 定性检测的操作步骤.. (3)A. 为PKC 检测准备组织或细胞样品 (4)B. PKC 检测操作步骤 (4)C. 为PKA 检测准备组织或细胞样品 (6)D. PKA 检测操作步骤 (7)E. 凝胶的制备............................................................................................9 F. 用电泳分离磷酸化和未磷酸化的PepTag ®短肽. (19)IV. 对PepTag® 检测结果进行定量分析 (10)A. 通过分光光度法定量................................................................... .. (10)B. 活性的计算 (11)C. 通过光密度扫描法定量 (13)D. 通过荧光分光光度法定量........................................................................13 V. 参考文献............................................................................ .................14 VI. 附录.. (15)A. 缓冲液和溶液的配方 (15)B. 相关产品.............................................................................................16 VII. 实验小提醒.. (16)I. 描述对蛋白激酶以及它们在细胞调控中的作用的研究是一些不断发展领域。
PTK激酶及其检测方法
PTK激酶PTK激酶即蛋白酪氨酸激酶，是一类催化ATP上γ-磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶，能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化，在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。
迄今发现的蛋白酪氨酸激酶中多数是属于致癌RNA病毒的癌基因产物，也可由脊椎动物的原癌基因产。
根据PTK是否存在于细胞膜受体可将其分成非受体型和膜受体型。
1.非受体型以src基因产物为代表，此外还有Yes、Fyn、Lck、Fgr、Lyn、Fps/Fes及Ab1等。
徐后两者外，其余非受体型蛋白酪氨酸激酶Src家族分子理约为60kDa的蛋白质，它们之间除了N末端80个氨基酸组成不同外，其作部分都非常相似。
2.受体型根据它们的结构不同，受体型酪氨酸激酶可以分为9种类型，其中较常见的有4种类型（图8-5）。
（1）表皮生长因子受体（EGFR）家族：EGF-R家族成员包括EGF-R（分子量为170kDa，广泛表达于多种组织细胞中）、erbB2/neu 及erbB-3基因表达产物。
其家族成员的特点是在胞膜外有两个富含半胱氨酸的区域，胞浆内含有一个有酪氨酸激酶活化性的区域。
（2）胰岛素受体家族：其家族成员包括胰岛素受体（insulin receptor,IR）、胰岛素样生长因子-1受体（insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R）以及胰岛素相关受体（insulin related receptor,IRR）。
胰岛素受体家族成员是由二个α亚单位和二个β亚单位通过链间二硫键形成的异源四聚体。
其中α亚单位为配体结合部位；β亚单位的胞浆内部分含有酪氨酸激酶活性区域。
（3）PDGF/MCSF/SCF受体家族：其家族成员包括血小板衍生的生长因子α受体（PDGF-αR）、PDGF-βR、巨噬细胞集落刺激因子受体（M-CSFR）以及干细胞生长因子受体（SCFR）。
以上成员的特点是胞膜外含有5个免疫球蛋白样结构域，胞浆内含有两个呈串联结构的酪酸激酶功能区。
体外激酶法
体外激酶法体外激酶法( in vitro kinase assay) 是用于研究蛋白激酶的酶学活性和底物特异性的一种常用方法。
该方法能够评估药物作用于多种疾病发生发展过程中蛋白的活性，通过分析与正常状态相比的变化，来判断药物效果。
此外，体外激酶法也可用于研究蛋白磷酸化信号通路及蛋白互作等领域的研究。
该方法通常使用可自行磷酸化底物，并且同时使用放射性同位素或荧光染料标记底物，从而可以在放射计或者荧光光谱仪中研究激酶的酶学特性。
其中，放射性同位素标记法是应用最普遍的方法之一，而荧光法则通常更适用于高通量筛选，因为它具有更好的时间和空间分辨率，同时也减少了对人体健康的危害。
体外激酶的反应体系由酶、底物、反应缓冲液及酶的辅因子等一系列组成的。
司欣、酪氨酸激酶、Insulin-like growth factors receptor （IGFR）等是通常用于体外激酶测定的酶。
在反应缓冲液中一般含有磷酸化底物，酶的激活剂、磷酸酸化试剂，使底物被磷酸化并能够再生底物，则采用添加三种调控步骤的反应体系，反应后用放射化学方法或化学发光技术检测磷酸化反应。
由于反应缓冲液在实验中极为重要，不同的实验物理条件可以对酶性活性起到不同的影响，因此在进行体外酶活性测试时，选择合适的反应体系非常重要。
在进行体外酶活性测试前，需要对反应条件进行优化，如pH 值、离子强度、反应时间等等因素的优化，使测定结果稳定适合检测酶活性。
随着近年来生化技术的发展，高通量技术已广泛应用于体外激酶法中，这极大地简化了实验流程。
通过高通量技术，可以在较短时间内同时测试多个样品和多个酶的酶活性，从而实现快速大规模筛选研究。
例如，通过高通量筛选可一次检测多达1000-5000种不同底物与酶的反应性质及药物的敏感性。
凝胶内激酶测定法
凝胶内激酶测定法
凝胶内激酶测定法（英语：Gel In Vitro Kinase Assay，也被称为放射性标记激酶法）是一种在体外实验中测定蛋白质激酶活性的方法。
该方法利用了放射性标记的底物，通过观察底物在激酶作用下的磷酸化程度来测定激酶活性。
该方法的基本步骤如下：
1、制备放射性标记的底物溶液。
通常是将底物溶于磷酸缓冲液中，加入适量的放射性同位素标记磷酸盐（如ATP）。
2、制备凝胶，并将激酶样品添加到凝胶孔中。
凝胶通常由聚丙烯酰胺、甘油和去离子水等组成，可以提供三维环境以模拟细胞内环境。
3、将放射性标记的底物溶液加入到凝胶孔中，使底物与凝胶中的激酶接触。
4、孵育一定时间后，将凝胶进行放射性自显影。
由于放射性同位素标记的磷酸盐被掺入到底物中，因此可以通过放射性自显影观察到磷酸化的底物。
5、通过测量底物磷酸化程度来计算激酶活性。
磷酸化程度可以通过测量凝胶上不同区域的放射性强度来确定。
凝胶内激酶测定法具有较高的灵敏性和特异性，可以用于测定多种蛋白质激酶的活性，包括细胞周期蛋白依赖激酶、丝裂原激活的蛋白激酶等。
该方法也可以用于研究激酶与底物的相互作用以及激酶抑制剂的筛选等。
小鼠腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)ELISA检测试剂盒简介说明
小鼠腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）ELISA检测试剂盒简介说明小鼠腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）ELISA检测试剂盒使用方法检测原理试剂盒采纳双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻di洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最后的黄色。
颜色的深浅和样品中的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），计算样品活性。
样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避开任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞快速当心地分别。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存：假如样本收集后不适时检测，请按一次用量分装，冻存于20℃，避开反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.510uL、220uL、20200uL、2001000uL3.37℃恒温箱操作注意事项试剂盒保存在28℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶wan全溶解后再使用。
试验中不用的板条应立刻放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对比或者空白；依照说明书操作时样本已经稀释5倍，最结束果乘以5才是样本实际浓度。
严格依照说明书中标明的时间、加液量及次序进行温育操作。
全部液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒构成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无停止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0S5）浓度依次为：0、10、20、40、80、160U/L 试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
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1.RT-PCR 测定PKCαmRNA 表达
用TRIZOL 一步提取法提取总RNA ,按Ivit rogen 公司Super Script First-st rand Synthesis For RT-PCR 步骤进行逆转录。
以β-actin 作为内参照。
引物序列, PKCα上游为5′-TGCTGACTTTGGGATGTG-3′, 下游为5′-
TGTTTGT2TCTCGCTGGTG-3′,扩增产物长度605 bp ;β-actin 上游为5′- TGACTTA GTTGCGTTACACCC-3′,下游为5′- CGAA
G2GCTCATCATTCAAAA-3′,扩增产物长度450 bp 。
RT 反应条件: 50 ℃ 30 min ,99 ℃ 5 min ,5 ℃ 5 min 一个循环。
PCR 反应条件: 94 ℃预变性2 min ,然后按照94 ℃ 30 s ,55 ℃30 s ,72 ℃ 1 min 进行30 个循环, 最后72 ℃延伸10 min。
2. Western blot 检测PKCα蛋白表达
（1）胞质、胞膜蛋白的提取:所有实验操作均在4 ℃下进行。
各样品取50 mg ,加入5 倍于湿重的粉碎缓冲液,剪碎、匀浆,4 ℃12 000 r/ min 条件下离心2 h ,上清液即为胞质蛋白。
将上述沉淀用2 ml 胞膜蛋白提取液悬起,超声粉碎后抽提30 min ,再于4 ℃12 000 r/ min 离心2 h ,上清即为胞膜蛋白。
将蛋白定量后,调定至等蛋白浓度备用。
（2）PKCα分析:取20μg 蛋白与等体积样品缓冲液混合,煮沸5 min ,十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶( SDS-PAGE)电泳,电转移至硝酸纤维素膜上, 5 %脱脂奶粉封闭3 h ,0. 1 % TTBS 清洗,加入PKCα 抗体、室温孵育过夜, 再用TTBS 清洗,以碱性磷酸酶标记的二抗室温孵育l h , TTBS清洗,与偶联辣根过氧化物酶的第二抗体( sigma) 反应,Western blot 增强化学发光法( ECL) 发光试剂显色并拍照。
采用图像分析仪分析蛋白条带灰度。
参考文献：孔垂泽，张哲，杨琦，孙丹，苗淼.蛋白激酶Cα在肾癌组织中的表达及临床意义
1.信号通路阻断剂法
阻断剂法是应用信号通路阻断剂( inhibitor) ,阻断其相对应的信号通路,再设立对照组或空白组,分别检测其相关生物学性状的变化,从而研究该信号通路的生物学作用。
2.蛋白质印迹分析(Western Blot)
利用Western B lot可以检测变化的蛋白质,进而推断出信号通路的变化及作用。
主要原理是:采用聚丙烯酰胺凝胶对被检测的蛋白质进行电泳,利用特异性抗体(一抗)与它所对应的抗原结合后,再用二抗使其显色。
通过分析着色的位置和
着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
阻断剂法需要的是特异性的阻断剂,Western blot需要的则是特异性的抗体(一抗) 。
3.聚合酶链式反应( Polymerase Chain Reac2tion, PCR)
RT - PCR技术的基本原理是:首先经反转录酶的作用由RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。
RT - PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中的基因表达水平、细胞中RNA的含量和直接克隆特定基因的cDNA 序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
Real - time PCR技术引入了一种荧光化学物质,其荧光强度会随着PCR产物的量变化而变化,可通过监测荧光来测定PCR 产物的量。
在PCR扩增期间,通过监测每一个循环荧光信号的强弱变化来即时测定特异性产物的量,从而实现对起始模板定性及定量的分析。
而且在整个过程中不需要取出PCR 产物进行电泳。
RT - PCR技术可用于半定量表达的检测,对基因的表达量进行比较,但不能检测PCR 信号放大之前的起始模板量; 而Real - time PCR技术则可以更精确的定量,在具体实验中可以根据需要来选择合适的方法。
4.RNA干涉(RNAi)
RNAi的作用机制可能是细胞内的双链RNA 在Dicer酶的作用下,形成小干扰RNA ( small interfering RNAs, siRNAs) ,siRNAs可进一步结合到核酸酶上并使其激活,从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA,完全抑制该基因在细胞内的翻译和表达。
5.荧光共振能量转移技术( Fluorescence rc-sonance energy transfer, FRET)
其主要原理是:应用荧光蛋白作为供体分子和受体分子,受到激发的荧光团可将能量通过偶极子- 偶极子作用将能量转移到另外一个受体,引起第二个荧光团的激发。
一旦发生了能量的转移,供体和受体之间必然存在供体荧光的淬灭和受体荧光活化的相关性。
而一些细胞因子在激活p38MAPK的过程中就有这种受体与配体之间的相互作用,就可以观察这个被激活受体和p38MAPK信号通路的相关性。
外界刺激因素向细胞内的信号传递一般认为是通过胞膜上的受体,当配体与受体结合后,引起受体构象变化或化学修饰,介导信号传递. 而FRET就可以用来研究受体和配体之间的相互作用。
基因芯片(Gene chip)
参考文献：解文博，叶玲.p38 丝裂原活化蛋白激酶信号通路的部分研究方法
免疫胶体金技术检测蛋白激酶定位
参考文献：张琳, 张璐, 朴英杰.应用改良的免疫胶体金包埋方法检测p38 蛋白激酶在Raw 细胞中的定位。