水稻TOS17突变体库的创建与应用

1文献综述1.1水稻基因组学研究现状1.1.2 水稻全基因组测序水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的粮食作物之一，全世界有一半的人口食用它，水稻年总产量占世界粮食作物产量第三位，维持较多人口的生活。

亚洲是世界水稻主产区，近年稻米产量占世界的90%以上，中国稻米年产量占亚洲的38%。

大米作为我国主要粮食种类，在养活我国13亿人口和改善我国居民营养结构中具有举足轻重的影响。

同时，水稻又以其基因组相对较小(～430Mbp)，高效的遗传转化体系，与玉米、大麦和小麦等其它禾本科作物在基因组上存在明显的共线性，而成为研究单子叶植物的模式植物。

国际水稻基因组计划(IRGSP)启动于1998年，以粳稻品种(japonica)日本晴(Nipponbare)为模式材料，由中国、日本、美国等是十个国家参与，所采用的方法为逐步克隆策略(clone by clone sequencing)，随后在2002年由日本和中国科学家率先公布了第1、4染色体的精确序列(Feng et al., 2002; Sasaki et al., 2002; Consortium 2003)；2003年9月第10条染色体的全长序列由美国Clemson大学公布(Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium, 2003)。

2005年8月水稻全基因组精确序列在Nature发表(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。

IRGSP公布的水稻“日本晴”精确序列经过分析表明：(1) 水稻“日本晴”基因组大小为389Mb，IRGSP公布的序列能够覆盖其全基因组的95%，并包含了所有的常染色质和两个完整的着丝粒；(2) 整个基因组中包含大约37544个非转座相关基因，其中71%的基因可能在拟南芥中有同源基因；(3)通过与拟南芥基因组序列对比分析发现，拟南芥90%的基因在水稻中可能存在同源物；(4) 水稻中预测的37544个基因中，29%是属于成簇的基因家族；(5) 水稻基因组中转座元件的数目和种类与玉米和高粱基因组共线性区段的扩张是一致的；(6) 有证据证明基因能从细胞器中转移到细胞核(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。

另外的一些科学研究部门和公司也分别启动了各自的水稻测序计划。

如华大基因在2005年宣布完成籼稻品种“93-11”的全基因组序列测序，其所采用的方法为鸟枪法。

Syngenta公司也于2002年宣布完成了粳稻品种“日本晴”的全基因组序列测序。

随着目前水稻基因组已测序完成，以及构建了水稻高密度的遗传图谱和高质量的物理图谱(Chen et al., 2002)。

同时获得了超过25万条来源于水稻不同组织的ESTs及28000条全长cDNA序列(Kikuchi et al., 2003)。

人们对有益基因的定位、克隆、转移和聚合越来越关注。

因此，可以说对水稻生命科学的研究步入到后基因组时代即对基因功能大规模研究的时代(Jeon et al., 2000)，其核心内容是植物功能基因组学。

因此，接下来的任务就是利用水稻功能基因组学，诠释全基因组测序所获得的遗传信息，分析基因的功能。

1.1.3 基于突变体的水稻功能基因组研究目前来讲克隆分析基因最有效的方法，就是利用突变体来研究分析基因的功能。

其基本原理是通过破坏植物基因内部或邻近位点，造成基因的突变。

然后再利用各种方法分离被破坏的基因。

目前构建饱和的基因突变群体，通过突变体分析鉴定基因已经成为最直接最有效的方法。

在水稻测序完成之前，植物学家利用一些自然产生的突变体及利用物理和化学等方法产生的突变体，克隆了一些控制水稻重要农艺性状的基因(Yoshimura et al., 1996; Yoshimura et al., 1998; Yano et al., 2000)，但自然界自发产生的突变很少，频率仅有10-5。

所以目前有很多的方法通过人为的手段提高突变频率，满足与构建大规模饱和突变题库的需要。

目前大规模构建突变体库的主要的方法有：物理和化学诱变法，T-DNA、转座子及反转绿转座子插入突变等。

1.1.3.1 物理和化学诱变物理和化学诱变主要是利用一些物理和化学的手段如快中子(Fast neutron)、伽玛射线(Gamma ray)、双环氧丁二烯(Diepoxybutane, DEB)、甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate, EMS) 等方法处理种子，然后通过播种处理的种子来筛选突变表型。

快中子轰击法是物理方法中被认为是非常有效的一种方法，快中子轰击往往导致基因组片段的缺失。

而以EMS诱导为代表的化学诱变的方法，往往导致DNA中的碱基转换，如G到A的转换。

物理和化学诱变的方法非常简单，快速和经济且不存在组织培养或遗传转化汇总基因型的限制，被广泛应用于大型突变体库的创建，如Li等(2001)利用Deletegene系统，在水稻中构建了含24,660个快中子轰击群体，筛选到5个基因位点，得到一个位点发生缺失的突变体。

而使用EMS作为化学诱变剂同样也可以得到遗传稳定的点突变体，而且已经被广泛用于水稻等植物诱变育种。

但是物理和化学的方法处理得到突变体，只能通过图位克隆的方法克隆基因，需要构建庞大的克隆群体，精细的遗传图谱，费时费力，无法适应大规模筛选鉴定突变体的要求。

1.1.3.2构建插入突变体库利用T-DNA、转座子和反转录转座子等插入元件，通过插入元件插入到植物基因组中，是植物基因不能正常的转录和翻译，达到破坏基因的效应产生突变体，而且可以通过插入元件很容易找到被插入元件的位点，目前构建插入突变体是最有效的构建大规模饱和突变体库的方法。

元件的插入效应是多样的。

Krysan等(1999)探讨了元件插入到植物基因组中后引起的靶位点基因功能的变化的几种情况：当插入元件插入到靶位点基因的编码区或启动子区就有可能使被插入的基因功能完全敲除，产生功能缺失性的突变体，即无义突变(null mutant)；当插入到启动子或3’端的非翻译区就有可能使靶位点基因表达量下降；当元件接上一个35S的启动子的时候，插入到基因的启动子区域，就可以使基因表达量上升；当插入基因编码区时，还有可能无法看到表型的缺失，因为高等植物中存在大量基因冗余的现象，突变基因的功能被其它同家族的基因补偿；在植物基因组内部存在多个拷贝的元件插入是，有可能多个基因被同时敲除掉，使多个基因同时失活；元件的插入还有可能导致插入位点附近的染色体重排的现象，本实验室张健同学的一个突变体就是由于插入位点附件的染色体重排，而引起植物出现一个不育的突变表型（私下交流）。

图1.植物基因组中中由T-DNA插入引起靶基因表达的不同效应（Kryson et al，1999）Fig1. The insertion of a T-DNA into a plant genome chromosome can lead to many different outcomesT-DNA(Transferred DNA)是农杆菌(Agrobacterium)的Ti质粒(Tumor-inducing Plasmid)上一段DNA序列，它可以从农杆菌中转移并稳定的整合到植物核基因组当中。

农杆菌介导的T-DNA转化技术已被广泛的应用于构建拟南芥和水稻的插入失活突变体库(Azpiroz-Leehan and Feldmann, 1997)。

如在拟南芥中已经建立饱和的插入突变体库(Alonso et al., 2003)。

随着水稻粳稻的高效遗传转化体系的建立(Hiei Y et al., 1994)，水稻中的T-DNA插入突变体库开始大量建立如本室已经建立了超过120,000个含有T-DNA标签的独立的转化子，平均每个突变体含有约为2.0个T-DNA拷贝，并且能稳定遗传(Wu et al., 2003)，并且通过对突变体的筛选，克隆到了一系列的重要基因如RID1(Wu et al., 2008)。

而其它的一些研究机构也纷纷建立了大型的T-DNA插入突变体库，如韩国的POSTECH研究所，法国的Genoplant研究所。

T-DNA在拟南芥中的插入被认为是一个随机的过程(Sallaud et al., 2004)，而在水稻中的插入则存在热点，如比较倾向于插入水稻中较大的染色体，倾向于插入远离着丝粒的区域，倾向于插入基因区，在基因的间隔区插入比较均一，倾向于插入基因编码区(Zhang et al., 2007)。

而且T-DNA插入也有一些缺点如：可能会引起插入位点的重排、插入过程中T-DNA的边界序列容易缺失，并且组织培养容易激活其它元件如Tos17。

Tos17是水稻中的一个内源性的反转录转座子，全长4114bp，在栽培稻中含有1-5个拷贝(Cheng et al., 2006)，并且在日本晴中有两个原始拷贝，一个位于第7染色体上，具有转座子活性，另一个位于第10染色体上，没有转座子活性活性，而现在认为第10染色体上一段20bp的碱基缺失，造成其转座活性的缺失。

Hirochika 等(1996)在1996年发现了15个水稻品种“日本晴”中的反转录转座子，其中Tos10，Tos17，Tos19在组培的条件下被激活，经过详细研究后发现Tos17具有以下特点：1.Tos17在组培的条件下激活，分化成植株后失活，因此Tos17插入引起的突变可以稳定遗传；2.Tos17的拷贝数随着组培的时间而增多，经5个月的组培后，可平均产生10个拷贝，可以通过组培时间的长短来控制转座的拷贝数；3.突变体产生过程不涉及转基因。

4.Tos17是水稻内源性的反转录转座子，因此在插入植物基因组内部时，一般不会产生片段的缺失和改变，而且相对于T-DNA，Tos17突变体的侧翼序列的分离相对容易。

因此Hirochika认为Tos17很适合用来构建插入突变体库。

并构建了超过50,000个独立的再生植株，大约含有500,000个插入位点，并对M2代突变产生的表型进行了详细的分类(Miyao et al., 2003; 2007)，发现后代中大约50%的家系出现至少一个突变表型，在田间出现最多的表型是不育和矮化。

但是Tos17突变体库也有一些缺点如其插入的拷贝数多，对以后的遗传分析不利；其产生的突变体只有10%是真正由Tos17的插入引起的，其余的突变体是在组培的情况下或是由其它的未知的转座子专座产生的。

Miyao等(2003)通过大量的Tos17的插入位点的分析发现，Tos17在水稻中的插入事件并不是一个随机的过程，存在热点，Tos17偏向于插入水稻中的较大的染色体，且插入密度和染色体大小高度相关。