免疫荧光技术的原理、分类及应用
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免疫荧光技术的原 理、分类与应用
2012-3-29
免疫荧光技术基本原理
免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显 微示踪的精确性相结合的一项技术 以荧光素作为标记物，与已知的抗体或抗原结合、但不 影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试 剂，用于检测和鉴定未知的抗原 在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原 抗体复合物及其存在的部位。 在实际工作中，由于荧光素标记抗体检查抗原的方法较 为常用，所以一般通称为荧光抗体技术
合适荧光素的选择
• • • • • 具有与蛋白质形成共价键的化学基团 荧光效率高，标记后下降不明显 荧光与背景的色泽对比鲜明 标记后能保持生物学活性和免疫活性 标记方法简单、快速、安全无毒
免疫荧光技术的主要优缺点
• 优点：特异性强、敏感性高、速度快 • 缺点：存在非特异性染色，结果判定 的客观性不足，技术程序也较复杂
根据实验方法分类
• • • • 直接法 间接法 补体法 其他
直接法
荧光 标记抗体 抗原
• 将荧光标记的特异性 抗体（抗原）直接加 在抗原（抗体）上， 经一定的温度和时间 染色，水洗-干燥-封 片-镜检 • 操作简便、特异性高、 非特异性染色少 • 敏感性低
间接法
荧光 未标记 未知抗原 抗体 标记抗 体
荧光的产生
• 物质吸收外界能量进入激发状态，再 回到稳定基态时，多余的能量会以电 磁辐射的形式释放，即发出荧光，这 类物质被称为荧光素。 • 由光激发所引起的荧光，为光致荧光 ——荧光免疫技术 由化学反应引起的荧光，为化学荧光 ——化学荧光技术
荧光素的荧光特性
• 停止供能，荧光现象随即终止 • 对光的吸收和荧光的发射具有高度的选择 性 发射光的波长>入射光波长 • 荧光效率： 发射荧光的光量子数 荧光效率= 吸收光的光量子数 荧光淬灭现象：荧光素的辐射能力减弱
荧光偏振免疫分析技术
利用荧光素经单一波长的偏振光 照射后吸收光能，释放出相应的偏振 荧光，荧光偏振程度与荧光分子大小 成正比的关系而建立的免疫分析技术
• 先用已知未标记的 特异抗体（一抗） 与抗原反应，再用 标记的抗体（二抗） 与其反应，形成抗 原-抗体-抗体复合 物，水洗-干燥-封 镜-镜检
补体法
标记抗 补体抗 体
补体
• 利用补体反应，通 过形成抗原-抗体补体复合物发射荧 光
பைடு நூலகம்
其他免疫荧光技术
• 时间分辨荧光免疫分析 • 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
利用具有双功能基团结构的螯合 剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原） 上，经免疫反应形成复合物，由于镧 系元素能发出荧光，故分离除去未结 合的成分后，利用时间分辨荧光仪即 可测定荧光强度，从而推测待测物含 量。
时间分辨荧光测定的特点
• 采用脉冲光源（每秒闪烁1000次以上的 疝灯），照射样品后即短暂的熄灭 • 以电子设备控制延缓时间，待非特异本底 荧光衰退后，再测镧系荧光。 • 镧系元素具有较长的荧光寿命，延缓测量 时间，能有效地消除非特异本底荧光 (10ns)的干扰 • 镧系螯合物的的激发光与荧光发射峰之间 的波长差异，有利于排除非特异性荧光干 扰，提高检测特异性。
2012-3-29
免疫荧光技术基本原理
免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显 微示踪的精确性相结合的一项技术 以荧光素作为标记物，与已知的抗体或抗原结合、但不 影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试 剂，用于检测和鉴定未知的抗原 在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原 抗体复合物及其存在的部位。 在实际工作中，由于荧光素标记抗体检查抗原的方法较 为常用，所以一般通称为荧光抗体技术
合适荧光素的选择
• • • • • 具有与蛋白质形成共价键的化学基团 荧光效率高，标记后下降不明显 荧光与背景的色泽对比鲜明 标记后能保持生物学活性和免疫活性 标记方法简单、快速、安全无毒
免疫荧光技术的主要优缺点
• 优点：特异性强、敏感性高、速度快 • 缺点：存在非特异性染色，结果判定 的客观性不足，技术程序也较复杂
根据实验方法分类
• • • • 直接法 间接法 补体法 其他
直接法
荧光 标记抗体 抗原
• 将荧光标记的特异性 抗体（抗原）直接加 在抗原（抗体）上， 经一定的温度和时间 染色，水洗-干燥-封 片-镜检 • 操作简便、特异性高、 非特异性染色少 • 敏感性低
间接法
荧光 未标记 未知抗原 抗体 标记抗 体
荧光的产生
• 物质吸收外界能量进入激发状态，再 回到稳定基态时，多余的能量会以电 磁辐射的形式释放，即发出荧光，这 类物质被称为荧光素。 • 由光激发所引起的荧光，为光致荧光 ——荧光免疫技术 由化学反应引起的荧光，为化学荧光 ——化学荧光技术
荧光素的荧光特性
• 停止供能，荧光现象随即终止 • 对光的吸收和荧光的发射具有高度的选择 性 发射光的波长>入射光波长 • 荧光效率： 发射荧光的光量子数 荧光效率= 吸收光的光量子数 荧光淬灭现象：荧光素的辐射能力减弱
荧光偏振免疫分析技术
利用荧光素经单一波长的偏振光 照射后吸收光能，释放出相应的偏振 荧光，荧光偏振程度与荧光分子大小 成正比的关系而建立的免疫分析技术
• 先用已知未标记的 特异抗体（一抗） 与抗原反应，再用 标记的抗体（二抗） 与其反应，形成抗 原-抗体-抗体复合 物，水洗-干燥-封 镜-镜检
补体法
标记抗 补体抗 体
补体
• 利用补体反应，通 过形成抗原-抗体补体复合物发射荧 光
பைடு நூலகம்
其他免疫荧光技术
• 时间分辨荧光免疫分析 • 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
利用具有双功能基团结构的螯合 剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原） 上，经免疫反应形成复合物，由于镧 系元素能发出荧光，故分离除去未结 合的成分后，利用时间分辨荧光仪即 可测定荧光强度，从而推测待测物含 量。
时间分辨荧光测定的特点
• 采用脉冲光源（每秒闪烁1000次以上的 疝灯），照射样品后即短暂的熄灭 • 以电子设备控制延缓时间，待非特异本底 荧光衰退后，再测镧系荧光。 • 镧系元素具有较长的荧光寿命，延缓测量 时间，能有效地消除非特异本底荧光 (10ns)的干扰 • 镧系螯合物的的激发光与荧光发射峰之间 的波长差异，有利于排除非特异性荧光干 扰，提高检测特异性。