WB步骤

Western blot 流程梳理

第1步：细胞蛋白提取

1.1物品：细胞，1ml/200ul/100ul 移液枪/枪头，1.5ml EP管。

1.2试剂：PBS：购买1L 装PBS粉剂配制，过滤后使用；

RIPA裂解液：1ml原RIPA裂解液+ 10 ul PMSF 配制。

1.3细胞步骤：从细胞间取6孔板———PBS洗涤：1ml枪移去培养液，加PBS轻柔洗涤3遍———加RIPA裂解液：150ul每孔，加液时分散点加，有助于裂解液充分接触细胞———反应5min———刮脱：用细胞刮反复刮脱细胞，微微倾斜孔板，将液体刮于一侧便于吸出，将各孔内液体分别吸到相应的1.5ml EP管中，注意应事先编号便于区分———超声震碎：按照说明震碎细胞，使细胞内蛋白充分析出———离心：超速离心机12000G 离心15min———转移：从离心机中取出样本，取出上清液与相应1.5ml EP管中，剩余沉淀舍弃，注意事先标记———各取20ul样本与另一相应EP管用于测蛋白浓度，剩余放于–80℃保存。

1.4组织提蛋白步骤：剪取组织适量(3mm*3mm*3mm左右大小)，用PBS洗去血液，滤纸吸干水分，放于1.5ml EP管中，加RIPA裂解液500ul，小剪刀伸入EP管中剪碎组织，使用电动匀浆机伸入EP管液面下充分搅碎组织，然后离心、转移上清液的操作如前。

1.5取出用于测蛋白浓度20ul样本处理：于各EP管中分别加入180ul 三蒸水得20倍稀释液，放入4℃保存或现用。

第2步：测蛋白浓度——Lorry法

2.1.配置lorry A/B液

配方：A液(250ml)：

2.2标准蛋白液的制备

取15ml离心管，三蒸水清洗3次，保证干净———精确称取牛血清白蛋白（ABV）20.0mg ,加入三蒸水10ml,充分混匀，得2mg/ml蛋白溶液———分装：1ml/支分装于1.5 ml EP管中；取250ul 2mg/ml蛋白溶液于1.5ml EP 管中，加三蒸水750ul，得0.5mg/ml蛋白标准品。

按下表配置0、25、50、100、200、300、400、500 ug/ml 蛋白梯度标准品各500ul，做好相应标记，4℃冰箱

事实上，实验室同学都是用购买的0.5mg/ml在96孔板上现配不同浓度标准蛋白制作标准曲线。一次性配制较多不同浓度标准蛋白优缺点如下：

优点：1.加样时加样体积较现配大，减少加样误差；2.一次性配制储存，上样时直接有现成不同浓度梯度标准品，缩短上样时间。

缺点：1.蛋白水溶液放置时间过长易降解；2.配制标准品为从试剂商购买牛血清白蛋白，较购买现成的蛋白标准品精确性差。

2.3.Lorry法测蛋白含量

使用96孔板上样，因每孔最多能装约300ul，故上样体积减半如下。

2.31取15ml干净离心管，蒸馏水涮洗3遍，00甩干水，依次加入10ml A液、100ul B液，摇匀得Lorry C液，室温反应10 min。

2.3.2 C液反应期间，各孔依次加入梯度蛋白标准溶液、样本（一般各加2组，每组8孔，同一浓度吸光度取平均值）150ul———各孔依次加入C液50 ul———各孔依次加入Folin酚15ul———暗室避光反应45min———分光光度计630 nm处测吸光度。

2.4标准曲线的绘制

实验室酶标仪设置630nm 下测定各孔内分光度———复制数据至excel表格———除去未加样品无效数据———将各梯度浓度标准品及样品重复加样所得的两个吸光度值分别取平均值。

以各梯度浓度标准品吸光度作为x变量，浓度作为y变量作标准曲线，可舍弃部分明显偏离值，在设置中显示标准公式，标准曲线α2需大于0.99才可以使用。

将各样本吸光度均值带入回归公式求得所测样本总浓度，但因所测样本实为原样本稀释20倍所得，故提取样本蛋白总浓度需乘以20。以最小浓度组体积为标准配平，分别计算要是各提取样本总蛋白浓度相等需要多少体积原液,再用PBS配平。

从–80℃冰箱取出原蛋白样本，按照计算体积配平至所需浓度，加入1/4体积的5乘loading buffer，震荡摇匀，沸水煮10min至蛋白完全变性减少降解损耗，再次放入-80℃冰箱备用。

第3步：配胶

3.1试剂：dd H2O，29%(w/v)丙烯酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液，pH 6.8 1M Tris-HCl，pH 8.8 1.5M Tris-HCl，10% SDS，10% AP，TEMED

配方：

3.2物品准备：50ml 离心管2个(分别专门用于配分离胶、浓缩胶，标签标明用途防止混淆)，离心管架，烧杯，各量程枪、枪头，配胶玻板，配胶架，配胶梳子，橡胶垫。

3.3步骤：

3.3.1.准备罐胶槽：将玻璃板擦干净烘干后，放入配胶架，两玻璃板及架子的底缘须在同一平面对齐（否则漏胶）；装上橡胶垫，将短架子装在长架子上，短架子底缘须与垫片紧密接触，否则漏胶。

3.3.2.准备：将各溶液（ddH2O，29%(w/v)丙烯酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液，Tris-HCl，SDS，APS，TEMED）依次摆好，调好取TEMED、APS的枪。

3.3.3.配分离胶：在烧杯上装半杯ddH2O；在专门装分离胶的50ml离心管中按下表所需浓度分离胶比例，依次加相应体积ddH2O，29%(w/v)丙烯酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液，Tris-HCl，SDS。最后加APS、TEMED，加样时要迅速，快速摇匀。用1ml枪将胶从玻璃板中间注入，注胶速度均匀，不要产生气泡，离心管中留少许以观察胶凝固情况。罐胶后用异丙醇压胶，注入异丙醇时要均匀轻柔。分离胶凝固约30min。

3.3.

4.配浓缩胶：分离胶离心管中交凝固时可倒掉玻板见压胶异丙醇，用滤纸吸干残留水，注意不要触及胶面。按表格依次在浓缩胶专用50ml离心管中加入相应溶液，摇匀，迅速灌入玻板间，不要产生气泡，离心管中留少许以观察胶凝固情况。浓缩胶凝固快，灌胶后即刻轻柔插入配胶梳子，不要产生气泡。5-20min浓缩胶即可凝固。

3.3.5.配胶凝固后轻柔取下玻板，胶现用加样，也可保鲜膜包裹后放入4℃冰箱存放充分凝固。4℃过夜凝固的