酵母表达系统
酵母表达系统
4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策
载体稳定性 基因剂量 整合位点 甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性
1）载体稳定性
同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化：
选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子 ，但费时，整合位点不确定。 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚
2）基因剂量
外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子
载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数 与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。 体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体
3）整合位点
外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均 可高效表达 毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点 的低
2）分泌表达产物过糖基化
（二） 甲醇酵母表达系统
甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇酵母表达系统的优缺点 甲醇酵母表达系统操作原理 甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 甲醇酵母表达系统的应用
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇酵母（methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。 毕赤酵母（Pichia pastoris) 汉森酵母（Hansenula ploymorpha) 假丝酵母（Candia boidinii)
组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活 性与药代稳定性均有影响。 *糖链组成
O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸 基团
4、酿酒酵母表达系统的缺陷
1）表达水平普遍不高 A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp） B、所采用的强启动子调控不严谨 C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵
酵母表达系统
C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL10 Promoter
GAL80
GAL4
UAS
GAL1
GAL7
GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
性结合因子：MF-α
酸性磷酸酯酶：PHO5
蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL
酿酒酵母信号肽特点
*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用
*信号肽结构：
Met 信号肽剪切位点
正电荷区 疏水区
极性区
目的蛋白
MF-α信号肽
*分泌效率高
*在酵母统具有通用性
*88个残基组成
Met KEX2 DAP DAP
AOX1与AOX2 *毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个AOX基因 AOX1、AOX2 *AOX1与AOX2基因97%同源 *AOX1 占主导地位，负责AOX 99%以上活性
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶启动子 A、目前已发现的、最强的真核启动子 B、严谨调控型启动子 AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导
8）表达产物稳定性
分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素
降低培养基pH值：蛋白酶在酸性条件下活性较低
培养基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制
采用蛋白酶缺陷宿主株：如P.pastoris SMD1168
3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达
酵母表达(1)
酵母表达引言酵母是一类单细胞真核生物，被广泛应用于生物学研究中。
酵母表达系统是指利用酵母细胞表达外源基因的技术，被广泛应用于蛋白质的高效表达和产量大规模生产。
本文将介绍酵母表达系统的原理、优势和应用。
原理酵母表达系统的核心原理是将外源基因导入酵母细胞，并通过酵母细胞的转录、翻译和修饰机制，使外源基因在酵母细胞中得到表达和功能发挥。
通常情况下，酵母表达系统主要采用酵母菌属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)作为宿主细胞。
1.酵母转录机制：酵母细胞的基因表达主要通过RNA聚合酶Ⅱ进行转录，产生mRNA分子。
2.酵母翻译机制：酵母细胞通过核糖体进行翻译，将mRNA翻译成蛋白质。
3.酵母修饰机制：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等。
优势相比其他常用的表达系统，酵母表达系统具有一系列的优势：1.高效表达能力：酵母表达系统能够实现高水平的外源基因表达，产量可达到克级。
2.翻译后修饰：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，使蛋白质得到正确的糖基化等修饰。
3.生长条件简单：酵母菌生长条件相对简单，可以在常规培养基中进行培养，对培养条件的要求相对较低。
4.可溶性蛋白质表达：酵母细胞具有较强的蛋白质折叠和修饰能力，能够高效地表达可溶性蛋白质。
应用酵母表达系统广泛应用于以下领域：1.蛋白质研究：酵母表达系统可用于大规模蛋白质表达和纯化，为蛋白质的结构、功能和相互作用研究提供了高效的工具。
2.药物筛选：酵母表达系统可用于药物靶点鉴定和药物分子筛选，加速药物研发过程。
3.疫苗研究：酵母表达系统可用于疫苗候选抗原的高效表达和产量大规模生产。
4.代谢工程：酵母表达系统可用于代谢工程领域，利用酵母细胞对外源代谢产物的高效合成能力，实现产生复杂化合物的目标。
5.生物制药：酵母表达系统已经被广泛应用于生物制药领域，用于生产重组蛋白和抗体等生物药物。
酵母菌的遗传工程和表达系统
酵母菌的遗传工程和表达系统酵母菌是一种常见的单细胞真菌，广泛存在于自然界中。
由于其易于培养、生长速度快、基因组较小、剪接机制类似于哺乳动物细胞等优点，酵母菌成为了功能基因组学、代谢工程学、蛋白质工程学等领域中的重要模型生物。
而酵母菌的遗传工程和表达系统则为这些研究提供了基础和保障。
酵母菌的遗传工程主要包括基因克隆、拷贝数调控、基因敲除、基因组编辑、基因表达调控、代谢通路调控等方面。
其中，基因克隆是构建目的基因载体的重要步骤，一般通过 PCR 扩增或基于荧光报告基因的克隆方法来实现。
而拷贝数调控则指通过操纵载体的拷贝数，达到目的蛋白在酵母细胞中表达量的控制。
酵母菌具有高度重组能力以及泛素降解酶机制，因此基因敲除和基因组编辑等操作在酵母菌中较为容易实现。
基因表达调控则是酵母细胞酿酒业中的重要应用，通过调节转录、翻译后修饰等环节来实现产品的调控。
代谢通路调控则是通过调节酵母菌内一系列代谢酶的表达量或活性来增加特定产物的产量。
酵母菌的表达系统则包括基于质粒的表达和基于基因组的表达两种方式。
质粒表达是将目的基因克隆至质粒中，然后将质粒转化至酵母细胞中，通过调控拷贝数和选择适当的启动子及终止子等措施实现表达。
而基因组表达则是将基因克隆至某一位点上，在酵母菌表达生命周期较长的时期内带来更稳定的表达效果，尤其适用于连续表达大规模生物分子的场合。
同时，可以采用多个方面的策略来处理表达过程中可能出现的问题，从而进一步优化表达效率和表达质量。
例如在 translational initiation 上加入特定元件、利用内质网信号肽将蛋白定向到内质网，从而利用内质网发生的翻译后修饰增加表达质量等等。
总之，酵母菌的遗传工程和表达系统为现代生物技术研究和产业化提供了重要的平台，无论从理论研究还是实践应用的角度来看，都具有广泛的前景和应用价值。
我们期待，基于酵母菌的遗传工程和表达系统将吸引更多的生物学家、遗传学家、代谢工程师、蛋白质化学家等多个领域的专家和研究人员的关注，一起推进这一新兴领域的发展和进步。
酿酒酵母表面展示表达系统及应用
凝集素展示表达系统
凝集素展示表达系统
凝集素展示表达系统
絮凝素展示表达系统
絮凝素Flo1p 是一种新兴的展示系统,它是酿酒酵母细 胞表面类似凝集素的细胞壁蛋白。 • 目前，已经形成了两种类型的絮凝素展示系统 ： • 一是GPI 系统 ；根据目的蛋白的特性和实验目的确定截去 Flo1p 肽段的长度,然后,目的蛋白的C 端融合到锚定序列 上。 • 二是利用Flo1p 的絮凝结构域的黏附能力创建一个表面展 示系统。
• 其中分别由AGα1、AGa1／AGa2和Flo1表达异源蛋白的 凝集素和絮凝素酵母细胞展示表达系统应用较多。
凝集素展示表达系统
α凝集素和ａ凝集素是酵母细胞壁上的两种甘露糖 蛋白，它们在酿酒酵母的交配型α（ＭＡＴα ）和 交配型ａ（ＭＡＴａ）单倍体细胞之间介导细胞 与细胞的性粘附，使细胞融合形成双倍体 。
二、两种系统
•
酿酒酵母细胞壁主要由外层的甘露糖蛋白和内层的葡
聚糖骨架组成，两者通过共价健相连。外层甘露糖蛋白有
两种类型：
• 一种是通过非共价健与酵母细胞壁松散相连并能被ＳＤＳ 提取出来的低分子量蛋白；
• 一种是必须被葡聚糖酶酶解细胞壁的β-１，3-和β-１，６葡聚糖层后才能被ＳＤＳ抽提的高分子量蛋白，包括凝集 素、絮凝素、Sed1p、Cwp1p、 Cwp 2p和Tip1p、Tir1p 、Srp1p等。后者的结构中大多都含有GPI锚定区域
主要内容
1
概念2两种系统来自3 应用4优缺点
一、概念
酿酒酵母表面展示表达系统： 一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统，
即把异源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融 合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母细胞内蛋白转运 到膜表面的机制（糖基磷脂酰肌醇，GPI锚定）， 使靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面，之后用葡聚 糖酶抽提细胞壁目的蛋白。
酵母表达系统在药物研发中的应用研究
酵母表达系统在药物研发中的应用研究酵母表达系统是一种利用酵母菌将外源基因表达的技术。
它广泛应用于药物研发中，是一种重要的基础研究方法。
下面就来探讨一下酵母表达系统在药物研发中的应用研究。
一、酵母表达系统的基本原理酵母表达系统是利用酿酒酵母菌，将外来基因导入到酵母菌中，使其表达外源蛋白质。
外源基因通常以质粒的形式封装进入酵母细胞中，而通常采用的质粒是pYES2、pESC、pGADT等。
这些质粒都具备不同的特定序列，这些序列可以使酵母表达系统实现不同的功能。
在酵母菌表达外源蛋白的过程中，其主要遵循四个步骤:转录、翻译、修饰和定位。
其中，转录和翻译过程非常类似于真核细胞的情况，最终将形成蛋白质。
但是，由于酿酒酵母是一种真核细胞，因此它的蛋白质修饰和定位过程与真核细胞的过程也非常接近。
二、酵母表达系统在药物研发中的应用1. 基因筛选酵母表达系统是基因筛选的一种常用方法。
基因筛选是通过对外源基因随机插入到酵母细胞中，然后判断是否会导致生长缺陷或特定表型的改变。
这种方法常用于寻找与信号转导、代谢途径和基因调控等过程相关的基因。
2. 蛋白结构研究人类的某些蛋白在体内的折叠会受到转录后修饰的影响，出现拓扑结构的变化会对其功能产生很大影响。
利用酵母表达系统就能够在短时间内对蛋白质结构进行研究。
通过酵母菌表达外源蛋白的方法，可以使加入原蛋白质的一段序列在折叠时进行彻底的探究，便于寻找相应的结构域。
3. 药物筛选在药物研发中，酵母表达系统也常被用于药物筛选。
通过酵母表达外源蛋白的方法，可以筛选出一种或多种能够调控目标蛋白的物质，从而对药物进行优化。
例如，先在酵母菌中表达目标蛋白，在检测其功能后，针对它的活性位点进行筛选最优化的化合物。
这就是所谓的基于蛋白的药物发现。
三、酵母表达系统的优势和局限酵母表达系统在药物研发中有着广泛的应用，这是因为它具有许多优点。
首先，酵母表达系统简单、成本低。
其次，酵母表达系统样品预备时间短，能够快速得到高度纯净的蛋白质。
酵母表达体系构建
酵母表达体系构建酵母表达体系是一种常用的基因表达系统，可以用于生产重组蛋白质、疫苗、抗体等生物制品。
构建酵母表达体系需要选择合适的酵母菌种、载体、目的基因以及必要的宿主细胞，并通过基因克隆、转化、筛选等一系列步骤实现。
本文将详细介绍酵母表达体系的构建过程。
一、选择酵母菌种和载体1．酵母菌种选择：根据需要表达的蛋白质的种类和性质，选择适合的酵母菌种。
常用的酵母菌种有Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）、Pichia pastoris（毕赤酵母）等。
2．载体选择：载体是携带目的基因进入宿主细胞的必要元件，常用的载体包括质粒、整合型载体和噬菌体载体等。
在构建酵母表达体系时，应根据目的基因的性质和表达量要求选择合适的载体。
二、目的基因的克隆和鉴定1．基因克隆：将目的基因插入到载体中，形成重组DNA分子。
可以通过PCR、基因文库等方法获取目的基因，也可以从基因组或cDNA文库中筛选出目的基因。
2．转化宿主细胞：将重组DNA分子导入到宿主细胞中，常用的方法包括电穿孔法、转化法等。
3．阳性克隆筛选：通过菌落PCR或 southern 杂交等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。
4．序列分析：对阳性克隆进行序列分析，确保目的基因正确插入载体中，并且没有发生任何突变。
三、构建酵母表达体系1．质粒制备：从阳性克隆中提取重组质粒，并进行纯化和鉴定。
2．转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，常用的方法包括电穿孔法、热激法等。
3．筛选阳性克隆：通过 southern 杂交等方法筛选出含有重组质粒的阳性克隆。
4．鉴定表达产物：对阳性克隆进行蛋白质表达水平检测，常用的方法包括 western 杂交、ELISA等。
同时对表达产物进行生物活性检测，以评估表达产物的质量和功能。
5．优化表达条件：通过对培养条件（如温度、pH值、营养物质浓度等）进行优化，提高目的基因的表达水平和产量。
6．生产与纯化：在优化条件下进行大规模培养和表达，并对表达产物进行纯化和加工，以满足实际应用需求。
酵母菌在蛋白质表达和纯化中的应用
酵母菌在蛋白质表达和纯化中的应用酵母菌是一种常见的单细胞真菌，不仅广泛存在于自然界中的各种环境中，而且是工业和科学研究领域中最常用的微生物模型之一。
在生物技术领域中，利用酵母菌的转化和表达能力，已经成功地生产出了许多有用的蛋白质和药物。
尤其是在蛋白质表达和纯化方面，酵母菌作为一种非常有效的表达宿主，为科学家们提供了许多解决方案。
I. 酵母菌的表达系统酵母菌最为常见的表达系统是酵母菌表达系统，这个系统与大肠杆菌表达系统相似但更为复杂。
酵母菌表达系统在表达异源蛋白质时，经常用到的是酵母菌基因的启动子，其中最常用的是PGK（磷酸甘油酸激酶）启动子。
在翻译过程中，酵母菌常常会产生一些问题，例如蛋白质不稳定，在表达系统中导致快速降解；蛋白质不足等。
这些问题的出现，可能会导致实验结果的不准确和不可靠。
II. 酵母菌表达系统的优点和不足酵母菌表达系统相对于大肠杆菌表达系统，具有许多优点。
首先，酵母菌表达系统可以产生一个与真菌生长相同的环境，因此合成的蛋白质往往更加稳定，并且可以进行正常的翻译和折叠。
其次，酵母菌表达系统采用有性生殖方式，可以进行原核和真核表达，使得酵母菌表达系统更加灵活。
此外，在表达大量蛋白质时，酵母菌表达系统具有优异的效率，并且有助于加速蛋白质的纯化过程。
然而，酵母菌表达系统相对于其他表达系统，存在缺点，例如构建较为复杂，不同型号的酵母菌具有巨大的多样性，因此需要对不同型号的酵母菌，进行不同的表达策略。
III. 酵母菌表达系统在蛋白质纯化中的应用在蛋白质表达和纯化中，酵母菌表达系统具有许多应用。
一方面，酵母菌表达系统可以用于高通量的蛋白质筛选，例如重组蛋白测序技术（ReSAP），可用于快速识别合适的表达宿主和优化蛋白质产量。
另一方面，酵母菌表达系统可以直接用于研究蛋白质的结构和功能，并且作为纯化蛋白质的一种重要工具，能够在纯化过程中帮助去除结构复杂的蛋白质杂质，提高纯化效率。
最近，酵母菌表达系统还被广泛应用于药物筛选和基因治疗等领域，已经产生了一系列有意义的研究成果。
酵母表达系统在蛋白质工程中的应用
酵母表达系统在蛋白质工程中的应用在现代生物技术领域中，蛋白质工程无疑是一个越来越重要的领域。
蛋白质工程的目的就是为了通过合成、改造、再造蛋白质，让它们发挥更好的作用。
但要想顺利实现这个目标，首先需要一个强大的工具——酵母表达系统。
本文将着重讨论酵母表达系统在蛋白质工程中的应用。
一、酵母表达系统的概述酵母表达系统指的是用酵母作为外源基因表达的宿主系统。
通常我们所使用的酵母表达系统分为两大类：酵母菌株（氨基酸合成型酵母、酵母菌、诺霉菌等）和酵母质粒。
酵母表达系统具有诸多优点：（1）表达效率高，含量可达30%以上；（2）修饰完备，可形成天然蛋白质的完整结构；（3）简单方便，培养条件简单，易于大规模生产。
二、酵母表达系统在蛋白质工程中的应用1. 蛋白质的可合成性: 酵母表达系统不仅适用于表达人类基因，而且还可以表达来自其他生物体的蛋白质基因。
例如，酵母表达系统可以用来合成的大肠杆菌中无法表达的大分子蛋白质，如人源性因子VIII和因子IX。
2. 蛋白质的结构保护: 酵母表达系统在表达可溶性蛋白质时，可以避免因过量表达而引起的蛋白质不正确折叠、表达时段不对，以及蛋白质酶解等问题。
此外，酵母表达系统还可以进行多肽连接和修饰，从而提高蛋白质稳定性和活性。
3. 蛋白质结构改造: 酵母表达系统不仅适用于合成蛋白质，还可以将已知结构的蛋白质进行改造，如改变蛋白质的区域，添加、改变或缩短结构域等，使其得到改进。
例如，可以通过酵母表达系统制备出抗体、酶及酶替代剂等以及多个域之间衔接的蛋白质，这些蛋白质具有与天然蛋白质相同的生物活性，且更加稳定。
4. 蛋白质的特定细胞定位: 酵母表达系统的另一个重要优点在于可以针对性地调控蛋白的表达定位。
例如，可以将表达在酵母中的蛋白转运到特定的亚细胞区域中，从而实现细胞定位和功能分化。
此外，通过改变酵母中的蛋白质结构、质量和量，可以增加细胞发酵性能、生物转化过程和蛋白质反应的有效性。
三、酵母表达系统面临的挑战与以上的优点相对应，酵母表达系统也存在着一些挑战：（1）构建表达载体；（2）寻找适宜的宿主菌株；（3）了解基因调控和宿主代谢途径；（4）选择适合的培养条件等。
酵母表达系统
酵母表达系统酵母表达系统基因表达是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术制备各种目的基因的重组蛋白质，在分析基因的表达与调控、基因的结构与功能、基因治疗以及生物制药等领域均取得了令人振奋的成果。
其中，酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。
1、酵母表达系统的特点酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。
酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。
某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。
应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。
解决内部降解的方法有三：一是在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物，通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用；二是将培养基的pH值调成酸性(酵母可在pH3.0~8.0的范围内生长)，以抑制中性蛋白酶的活性；三是利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。
另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。
因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。
2、常用酵母表达系统(宿主-载体系统)（1）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。
因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。
酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。
酵母表达系统-PPT课件
2）基因剂量
外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子
载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数 与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。
体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体
3）整合位点
外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均 可高效表达
高拷贝整合元件： A、高度重复序列：rDNA 提供多个整合位点 B、缺陷型标记基因：Leu2d
提高选择压力
C、抗性标记；neo 提高选择压力
甲醇酵母系统胞内表达载体
需要带入ATG
表达载体类型
单位点
甲醇酵母系统胞内表达载体
需要带入ATG
多位点
表达载体类型
甲醇酵母系统分泌表达载体
信号肽：PHO1
甲醇酵母系统分泌表达载体
KM71:His+Muts
3’His4
3） 多基因插入事件（串联整合）
宿主株:GS115、KM71
可插入位点： 5’AOX1
3’AOX1
TT
转化子： GS115:His+Mut+ KM71:His+Muts
4） 基因取代（GS115，AOX1+）
转化子：His4+Muts
汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体
信号肽：MFα
甲醇酵母系统分泌表达载体
信号肽：MFα 标记：Kan
4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策
载体稳定性 基因剂量
整合位点
甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性
1）载体稳定性
同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化： 选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子 ，但费时，整合位点不确定。 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚
真核生物之酵母表达系统
3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达
甲醇酵母系统宿主
二大宿主系统主要特点
项目 最适温度 最适pH值 甘油阻遏 毕赤酵母 30℃ 4.5 是 汉森酵母 37℃ 4.5 否
糖基化
高密度发酵
部分过度
100g/L
较正常
100g/L
甲醇酵母系统宿主
二大宿主系统主要选择标记
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL10 Promoter
GAL80
GAL4
UAS
GAL1
GAL7
GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
3）pho4TS-PHO5启动子
低温诱导、磷酸盐抑制 A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录
宿主株:GS115、KM71
可插入位点： 5’AOX1 3’AOX1
TT
转化子： GS115:His+Mut+
KM71:His+Muts
4） 基因取代（GS115，AOX1+）
转化子：His4+Muts
汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体
高拷贝整合元件： A、高度重复序列：rDNA
提供多个整合位点
3、酿酒酵母糖基化系统
糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）
N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖
基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。
O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化
酿酒酵母糖基化特点
* 过糖基化（超糖基化修饰）：
酵母表达手册
酵母表达手册
酵母表达系统是一种常用于生产重组蛋白质的方法，其利用酵母细胞作为宿主来表达外源基因。
以下是酵母表达系统的基本步骤：
1. 基因克隆和转化：将目的基因克隆到酵母表达载体中，常用的载体有质粒和整合型载体。
转化方法包括电转化和化学转化。
2. 重组蛋白表达：将转化后的酵母细胞接种到发酵罐中进行培养，在适宜的温度、pH和营养条件下，目的基因在酵母细胞中表达出重组蛋白。
3. 蛋白质纯化：通过一系列的纯化技术，如离心、过滤、沉淀、亲和层析等，将重组蛋白从酵母细胞中分离出来并进行纯化。
4. 蛋白质后处理：根据需要，对纯化的重组蛋白进行进一步的后处理，如去盐、脱色、除菌等。
5. 蛋白质检测：通过SDS-PAGE、Western blot等方法检测重组蛋白的表达水平和纯度。
6. 蛋白质功能研究：对纯化的重组蛋白进行生物活性检测和功能研究，如酶活测定、免疫分析等。
在实际应用中，需要根据不同的需求选择不同的酵母表达系统，如酿酒酵母表达系统、毕赤酵母表达系统等。
同时，还需要对重组蛋白进行质量分析和稳定性研究，以确保其用于后续的实验或生产中具有可靠性和有效性。
生物酵母高效表达系统的研究及优化
生物酵母高效表达系统的研究及优化绪论生物酵母高效表达系统在生物技术领域中扮演着重要的角色。
酵母是一种简单而又易于培养的真核生物，具有许多优点，比如高表达水平，易于扩大生产以及可调控的代谢途径。
然而，在使用酵母进行表达时，有一些因素需要考虑，以确保高效表达和最大化产量。
本文将探讨生物酵母高效表达系统的研究和优化。
一、研究生物酵母高效表达系统的原因1.1 酵母的生物学特性酵母是一种单细胞真核生物，其基因组具有高度保守性。
酵母细胞有类似于人类细胞的机制，这使得酵母可用作人类蛋白质的表达系统。
此外，酵母细胞的代谢通路与人类细胞有许多共同之处，因此可以通过酵母细胞进行药物筛选和代谢途径的研究。
1.2 酵母高效表达系统的优势相对于其他表达系统，酵母高效表达系统有以下优势：a) 高表达水平：酵母细胞拥有高度活跃的转录和转译机制，使其能够实现高水平的蛋白表达。
b) 易于扩大生产：酵母细胞的培养工艺相对简单，同时可以进行批量培养和连续培养。
c) 可调控的代谢途径：酵母细胞常用来研究特定代谢途径，并通过基因工程进行调控。
二、生物酵母高效表达系统的优化2.1 基因工程基因工程是生物酵母高效表达系统优化的关键。
通过选择适当的启动子、增强子和终止子以及优化启动子-转录因子相互作用，可以实现蛋白质表达水平的提高。
此外，通过插入调节元件，在表达过程中控制蛋白质的稳态水平，从而实现高产量表达。
2.2 优化培养条件培养条件对于酵母高效表达系统的优化至关重要。
适当的培养温度、pH值、培养基成分和添加剂选择可以提高酵母细胞的生存率和表达效率。
还可以通过调节培养基的营养物质浓度和培养过程中的氧气供应，进一步提高表达效果。
2.3 蛋白质稳定性的提高蛋白质在酵母细胞中的稳定性是影响高效表达的因素之一。
通过添加相关蛋白质降解途径的抑制剂，可以延长目标蛋白质的半衰期，从而提高其表达水平。
此外，在目标蛋白质的N-端或C-端添加稳定性标签，也能有效提高蛋白质的稳定性。
酵母表达系统
比较基因组学
通过比较不同物种之间的基因组 和转录组，分析生物进化的特征 和规律。
05 酵母表达系统的未来发展
提高表达产物的产量与质量
基因编辑技术
利用基因编辑技术，如CRISPR-Cas9，对酵母基因进行精确修饰， 以提高目标蛋白的表达量和纯度。
沉默子
沉默子是能够抑制基因表达的DNA序列，通过与转录因子结合来抑制基因的表达，在基因表达调控中具有重要作 用。
转录因子与基因表达调控
转录因子
转录因子是能够识别并结合DNA序列的蛋白质，通过与特定DNA序列的结合来调控基因的表达。
转录因子与基因表达调控
转录因子在基因表达调控中发挥关键作用，通过与启动子、增强子或沉默子等DNA序列的相互作用来 调节基因的表达。
蛋白质相互作用
通过酵母双杂交等技术研究蛋白质之间的相互作用，揭示基因调控 的分子机制。
基因突变分析
通过构建突变体分析基因突变对酵母生长、代谢等的影响，研究基因 的功能。
生物进化研究
物种进化
利用酵母表达系统研究物种之间 的进化关系，通过比较不同物种 之间基因表达的差异，揭示物种 进化的规律。
适应性进化
利用酵母表达系统生产食品添 加剂、酶制剂等，提高食品质 量和安全性。
农业领域
通过酵母表达系统改良农作物 ，提高抗逆性、产量和品质等
。
酵母表达系统的优缺点
优点
操作简便、周期短、成本低、可大规 模生产、安全性高。
缺点
表达水平相对较低、分泌蛋白的加工 和修饰能力有限、易受宿主菌遗传背 景的影响。
02 酵母表达系统的基本组成
对启动子、终止子等表达元件进行优化，提高其转 录和翻译效率，促进目标蛋白的表达。
毕氏酵母蛋白表达系统原理
毕氏酵母蛋白表达系统原理1.引言1.1 概述概述在生物科学研究中，表达外源蛋白是一个常见的实验手段，用以研究蛋白的结构和功能。
而毕氏酵母蛋白表达系统作为一种重要的表达系统之一，已经被广泛应用于各个领域，包括基因工程、药物研发和生物制药等。
本文将对毕氏酵母蛋白表达系统的基本原理和优势进行详细介绍。
毕氏酵母（Pichia pastoris）是一种单细胞真菌，具有高效的蛋白表达能力和较高的细胞密度。
毕氏酵母蛋白表达系统是基于毕氏酵母的遗传工程技术，通过将外源基因嵌入到毕氏酵母的基因组中，使其能够产生大量特定蛋白。
其主要原理是利用毕氏酵母的内源启动子和信号序列来调控外源基因的表达，并通过细胞代谢途径来实现对外源蛋白的正确折叠和修饰。
毕氏酵母蛋白表达系统相比其他表达系统具有许多优势。
首先，由于毕氏酵母的生长速度较快，表达时间相对较短，可以迅速得到目标蛋白。
其次，毕氏酵母能够产生大量的外源蛋白，产量可以达到克级甚至克拉级。
此外，毕氏酵母蛋白表达系统具有高选择性，外源基因在毕氏酵母中的稳定性较高，避免了外源基因的丢失或突变。
总之，毕氏酵母蛋白表达系统是一种广泛应用的表达系统，其基本原理和优势使其成为生物科学研究中重要的工具。
本文将进一步深入介绍毕氏酵母蛋白表达系统的基本原理和其在科学研究和应用中的潜力。
1.2 文章结构文章结构部分的内容如下：文章结构部分旨在介绍本文的整体框架和各个章节的内容安排，以便读者更好地理解和阅读本文。
本文包含引言、正文和结论三个主要部分。
1. 引言部分（Introduction）是文章的开篇，旨在引起读者的兴趣并提供对毕氏酵母蛋白表达系统原理的总体概述。
其中，1.1概述部分将简要介绍毕氏酵母蛋白表达系统的基本概念和背景信息；1.2文中结构部分（Article Structure）将详细介绍本文的整体结构安排，以便读者明确每个章节的内容；1.3目的部分（Objective）将说明本文的研究目的和意义，为后续内容提供背景和动机。
《酵母表达系统》课件
达。
单顺反子载体和多顺反子载体
03
分别用于表达单拷贝和多拷贝基因。
诱导表达系统
组成型表达
外源基因在宿主菌中持续表达。
诱导型表达
通过添加诱导物或改变培养条件来启动或增强外源基因的表达。
组成型与诱导型表达的比较
组成型表达稳定，但表达水平较低；诱导型表达水平较高，但操作 复杂。
转录和翻译调控元件
转录调控元件
表达载体的优化设计
表达载体的优化设计是提高酵母表达系统效率的另一个关键 因素。通过调整表达载体中的启动子、多克隆位点、终止子 等元件，可以实现对外源蛋白表达的精细调控。
例如，选择强启动子来驱动外源基因的表达，可以显著提高 目标蛋白的表达量。同时，合适的终止子可以确保外源基因 的正确转录和终止。
诱导表达系统的改进
诱导表达系统的改进是提高酵母表达系统效率的重要手段 之一。通过调整诱导剂的种类和浓度，可以实现对外源蛋 白表达的诱导和调控。
例如，利用组成型表达和诱导型表达两种方式来表达外源 蛋白，可以实现在特定条件下对目标蛋白的高效表达。
转录和翻译调控元件的调整
转录和翻译调控元件的调整是提高酵 母表达系统效率的关键因素之一。通 过调整转录和翻译过程中的各种元件 ，可以实现对目标蛋白表达的精细调 控。
科学研究
用于研究基因功能、蛋白质相 互作用等。
酵母表达系统的优势与局限性
优势 繁殖快，容易培养，可在短时间内获得大量表达产物。
操作简便，成本低，适合大规模生产。
酵母表达系统的优势与局限性
可通过基因工程手段对酵母进行改造 ，提高表达产物的产量和质量。
可用于生产多种类型的蛋白质和多糖 。
酵母表达系统的优势与局限性
01
第十章 酵母基因工程-08级
如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原 核生物表达系统， 核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核 生物表达系统。 生物表达系统。
2、酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚， ① 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚， 遗传操作简便； 遗传操作简便； ② 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工 系统； 系统； 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、 ③ 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、 成本低廉； 成本低廉； 能将外源基因表达产物分泌至培养基中； ④ 能将外源基因表达产物分泌至培养基中； 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA FDA认 ⑤ 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认 定为安全的基因工程受体系统（ 定为安全的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）； ）； 酵母菌是最简单的真核模式生物。 ⑥ 酵母菌是最简单的真核模式生物。
选择标记
对应于营养缺陷型受体的野生型基因：HIS4 (组氨醇脱 对应于营养缺陷型受体的野生型基因： 氢酶基因) 精氨酸合成酶基因)； 氢酶基因)；ARG4(精氨酸合成酶基因 ；TRP1(色氨酸 精氨酸合成酶基因 色氨酸 合成酶基因)； 尿嘧啶合成酶基因) 合成酶基因 ；URA3 (尿嘧啶合成酶基因)。 抗性选择标记：抗生素G418抗性基因和Zeocin G418抗性基因和Zeocin抗性基因 抗性选择标记：抗生素G418抗性基因和Zeocin抗性基因
2、酿酒酵母的附加型载体
pUC质粒的复制起点和amp pUC质粒的复制起点和ampr抗性基因 质粒的复制起点和 酵母菌的2μm质粒的复制区 酵母菌的2μm质粒的复制区 酵母转化的选择元件： 酵母转化的选择元件：LEU2(亮氨酸合成酶基因)； (亮氨酸合成酶基因)
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•巴斯德毕赤酵母 它是一种甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶基 因的高效表达，如乙醇氧化酶基因（AOX1）的表达产物可 在细胞中高水平积累。 AOX1的启动子是一种可诱导的强启
动子。以AOX1为启动子，选择AOX1基因缺失的突变株作为
受体细胞，可高效表达外源基因。 在毕赤酵母中得到表达的重组异源蛋白有乙型肝炎表面 抗原、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子、链激酶等几十种。 毕赤酵母的分泌表达能力比酿酒酵母强，但对其遗传背景了 解还比较少，且发酵周期也比较长。
Selecting a Pichia Expression Vector
pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点
Selecting a Pichia Expression Vector
Pichia Cloning
表达载体与毕赤酵母基因 组发生重组的方式：
1. 载体的3‘ AOX1区与基因组的
expression and can even lead to cell death. Other important facts: • Doubling time of log phase Mut+ or MutS Pichia in YPD is ~2 hours • Mut+and MutS strains do not differ in growth rates unless grown on methanol • Doubling time of log phase Mut+Pichia in methanol medium (MM) is 4-6 hours
AOX1基因的末端发生同源重组
2. 载体的HIS4区与基因组的HIS4 基因的末端发生同源重组
Gene Replacement at AOX1 in GS115
Multiple Gene Insertion Events
Cloning & Transforming in Yeast Cells
Growth on Methanol
When plates or medium containing methanol are used as growth medium, it is advisable to add methanol every day to compensate for loss due to evaporation or consumption. • For plates add 100 µl of 100% methanol to the lid of the inverted plate. • For liquid medium add 100% methanol to a final concentration of 0.5%.
•着丝粒型质粒载体（yeast centromeric plasmid， YCP）
该型质粒载体是在自主复制型的基础上，增加了酵母染色 体有丝分裂稳定序列元件。在细胞分裂时，质粒载体能平均分 配到子细胞中，稳定性较高，但拷贝数很低，通常只有1～2个 拷贝。 •酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）
酵母基因表达系统宿主菌
酿酒酵母 巴斯德毕赤酵母 主要包括 乳酸克鲁维酵母
多型汉森酵母
•酿酒酵母 它具有作为宿主菌必须具备的许多条件，是最早应用于 外源基因克隆和表达的酵母菌。目前已表达了诸如乙型肝炎 疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子等多种外源基因产 物。其缺点是在发酵过程中会产生乙醇，影响酵母的生长代 谢和基因产物的表达。此外，酿酒酵母在蛋白质的加工过程 中会发生过度糖基化作用，其分泌表达能力也有待提高。
酵母基因表达载体的种类
•自主复制型质粒载体（yeast replicating plasmid， YRP） 该载体含有酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记和 基因克隆位点等元件，能够在酵母细胞中进行自我复制。在 酵母细胞中的转化效率较高，每个细胞中的拷贝数可达200 个，但经过多代培养后，子细胞中的拷贝数会迅速减少。 •整合型质粒载体（yeast integration plasmid， YIP） 整合型质粒载体不含酵母DNA复制起始区，不能在酵母 中进行自主复制，但含有整合介导区，可通过DNA的同源重 组将外源基因整合到酵母染色体上，并随染色体一起进行复 制。质粒与染色体DNA的同源重组主要有单交换整合和双交 换整合两种方式。
Storage of Pichia Strains
To store cells for weeks to months, use YPD medium or YPD agar slants. • Streak for single colonies of GS115, KM71, or a His+transformant on YPD. • Transfer one colony to a YPD stab and grow for 2 days at 30 ℃. • The cells can be stored on YPD for several weeks at +4 ℃.
PCR Analysis of Pichia Integrants
Expression of Recombinant Pichia Strains
毕赤酵母表达系统中常用载体的基本结构
5'AOX1 启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇的诱 导下可启动外源蛋白的表达； α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列， 能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白 的纯化； 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提 供位点； TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号； HIS4为营养缺陷型筛选标志； 3' AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因同源重 组； 抗Amp 基因和pBR322复制起始位点，使载体可在 E.coli中筛选和复制。
• Doubling time of log phase MutS Pichia in MM is ~18 hours
• One OD600 = ~5 x 107 cells/ml Note：Growth characteristics may vary depending on the recombinant strain.
酵母表达载体包含两类复制起始序列：
在大肠杆菌中复制的复制起始序列
在酵母菌中引导进行自主复制的序列
•选择标记 营养缺陷型选择标记：它与宿主的基因型有关。 显性选择标记：可用于各种类型的宿主细胞，并提供直观的 选择标记。
•表达盒
表达盒由启动子、分泌信号序列和终止子等组成，是酵母 表达载体的重要元件。
启动子的长度一般在1～2kb，其上游含各种调控序列（如上游激活序列、 上游阻遏序列、组成型启动子序列等），下游存在转录的起始位点和 TATA序列（TATA序列可被质转录因子蛋白识别、结合并形成转录起始 复合物）。一般在构建表达载体时须组入强启动子，如酵母磷酸甘油酯激 酶（PGK）基因启动子、甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH）基因启动子等。 分泌信号序列是前体蛋白N端一段长为17～30个氨基酸残基的分泌信号肽 编码区，主要功能是引导分泌蛋白从细胞内转移到细胞外，并对蛋白质翻 译后的加工起重要作用。常用的分泌信号序列有：α因子前导肽序列、蔗 糖酶信号肽序列、酸性磷酸酯酶信号肽序列等。 终止子序列相对较短，是决定酵母中mRNA3′端稳定性的重要结构。与高 等真核生物类似，mRNA的3 ′端需经过前体mRNA的加工和多聚腺苷化反 应。
该载体在酵母细胞中以线性双链DNA的形式存在，每个细胞内只有 单拷贝，包含酵母染色体自主复制序列、着丝粒序列、端粒序列、酵母 菌选择标记基因、大肠杆菌复制子和选择标记基因等。 在细胞分裂和遗传过程中，能将染色体载体均匀分配到子细胞中， 并保持相对独立和稳定。酵母菌选择标记基因SUP4表达时转化子菌落呈 白色，不表达时呈红色。外源基因的插入可灭活SUP4基因，获得红色的 重组转化子。YAC载体可插入200～800kb的外源基因片段，因而特别适 合高等真核生物基因组的克隆与表达研究。
Growth of Pichia Strains
The growth temperature of Pichia pastoris is 28-30℃for liquid cultures, plates,
and slants. Growth above 32 ℃ during induction can be detrimental to protein
Pichia Expression
Cloning into the Pichia Expression Vectors Transformation into E. coli Preparing Transforming DNA
Transforming Pichia
Screening for Mut+ and MutS Transformants
酵母基因表达载体
酵母克隆和表达载体是由酵母野生型质粒、原核生物质 粒载体上的功能基因（如抗性基因、复制子等）和宿主染色 体DNA上自主复制子结构（ARS）、中心粒序列（CEN）、
端粒序列（TEL）等一起构建而成。
酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒，能在酵
母菌和大肠杆菌中进行复制。
•DNA复制起始区
基因表达系统
酵母表达系统
酵母（yeast）——是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细 胞真核生物，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。
酵母菌的ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ点：
基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，并于 1996年完成了对酿酒酵母基因组全序列的测定； 具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后加工和修饰系统； 可将外源基因表达产物分泌到培养基中； 对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒； 可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。