病毒的血凝及血凝抑制试验

病毒的血凝及血凝抑制试验

有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。

[目的要求]

掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。

[材料与试剂]

1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50L定量移液器，滴头，微型振荡器。

2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。

3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。

[实验内容及操作方法]

（一）血球凝集(HA)试验

1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50L生理盐水。

2. 于左侧第1孔加50L病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），

混合均匀后，吸50L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃

50L；第12孔为红细胞对照。

3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50L，在

振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。

表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：L）

孔号123456789101112

病毒稀释度1:

2

1:

4

1:

8

1:

16

1:

32

1:

64

1:1

28

1:2

56

1:5

12

1:1

024

1:2

048

对

照

生理盐水50505050505050505050505

病毒液5050505050505050505050

0.5%红细胞50505050505050505050505

50

结果观察++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

+++

+

+++++--

4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。

以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个

凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。

(二) 血球凝集抑制(HI)试验

1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。

2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50L生理盐水。

3. 第１孔加被检鸡血清50L，吹吸混合均匀，吸50L至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50L，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8 ……；第12孔加新城疫阳性血清50L，作为血清对照。

4. 自第1孔至12孔各加50L 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。

5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50L，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。

表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：L）

孔

号1234567891011

1

2

血清1:

2

1:

4

1:

8

1:1

6

1:3

2

1:6

4

1:1

28

1:2

56

1:5

12

1:10

24

病

毒

对

照

血

清

对

照

6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（++++），而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。

以100％抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。

从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。

附录

1. 阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液

枸橼酸钠（5H2O） 0.80g

枸橼酸（H2O） 0.055g

葡萄糖 2.05g

氯化钠 0.42g

双蒸水加至 100 ml

将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115℃灭菌10min,4℃保存备用。

2. 0.5% 鸡红细胞制备方法

先用灭菌注射器吸取 3.8% 枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的1／5)，从鸡翅静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成0.5% 鸡红细胞悬液。

3. 96孔微量反应板的清洗

将浸泡有75% 乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板5次，再用蒸馏水冲洗3次以上，置37℃温箱中干燥。