碱性单细胞凝胶电泳铺胶技术的改进

　3复旦大学985项目基金资助

碱性单细胞凝胶电泳铺胶技术的改进3

高建军　丰盛梅　金慰芳

(复旦大学放射医学研究所骨代谢研究室上海　200032)

【摘要】　目的　聚苯乙烯孔槽单层铺胶技术在碱性单细胞凝胶电泳中的可行性研究。方法　自制聚苯乙烯孔槽的载胶片,将1%低熔点凝胶与淋巴细胞混合后单层铺胶,经6G y γ射线照射后进行碱性单细胞凝胶电泳,观察胶面和淋巴细胞的DNA 损伤情况。结果　载胶片孔槽单层灌胶后胶面平整,操作过程无脱落;淋巴细胞

DNA 电泳图像清晰,6G y 照射产生的“彗星”形态特征明显。结论　采用聚苯乙烯孔槽进行单层铺胶的技术,可

以克服碱性单细胞凝胶电泳中的胶板脱落等问题。

【关键词】　碱性单细胞凝胶电泳;　聚苯乙烯孔槽;　琼脂糖;　γ射线照射【中国图书馆分类法分类号】　R 811.5

Improvement of G el Preparation on Alkali Single Cell G el Electrophoresis

G AO Jian 2jun ,FEN G Sheng 2mei ,J IN Wei 2fang

(Bone Metabolism Department ,Institute of Radiation Medicine ,Fudan U niversity ,S hanghai 200032,China )

【Abstract 】　Purpose To determine the possibility of the mono 2layer gel on ploystyrene ponds used in alkali

single cell gel electrophoresis (ASCGE ).　Methods The carried slice was prepared with the cover of tis 2sue 2culture plate.The mono 2layer gel plates were made by filling the polystyrene ponds with 1%LMA em 2bedded lymphocytes and exposed to 6G y γrays irradiation ,then analysis were performed by comet assay in alkaline solution.　R esults The gel surface was smooth and glossy and there was no gel departure or drift in the operate process.The DNA images were clear and the comet morphological character was showed obvi 2ously in the cells exposed to 6G y γrays irradiation.　Conclusions The mono 2layer gel on polystyrene ponds can avoid the gel departure and drift in ASCGE.

【K ey w ords 】　alkali single cell gel electrophoresis ;　polystyrene pond ;　agarose ;　

γrays irradiation 碱性单细胞凝胶电泳(alkaline single cell gel

electrophoresis ,ASCGE )技术,是单细胞凝胶电泳,又称彗星分析技术(comet assay )中的一种技术,可于单细胞水平快速灵敏检测DNA 单链断裂而得到广泛应用。但其制胶步骤多、时间长,胶板易损坏和胶落的问题没有很好解决,给该技术的规范和推广带来一定困难。因此,我们尝试采用聚苯乙烯孔槽进行铺胶,简化操作步骤。

材料和方法载胶片准备　取96孔细胞培养板(NUNC )盖,用美工刀裁成25mm ×68mm 大小载胶片(共16孔)若干,蒸馏水冲洗,置清洁处晾干。

铺胶　取淋巴细胞悬液(肝素抗凝,淋巴细胞分离液分离,锥虫蓝排斥试验存活率大于95%),PBS

稀释为4×104/mL 后与1%低熔点凝胶(LMA ,SIGMA )按体积1∶3混合,平铺在预温的载胶片孔槽内(18μL/孔),即转移至4℃暗盒。照射　将铺胶的载胶片置4℃湿盒内于137Cs 放射源(剂量率为0.9Gy/min ,G amma Cell 40)接受单次6Gy 照射。对照组带入准备室,不受照。

裂解、解旋和电泳　将受照后的载胶片小心浸入裂解液(2.5mol/L NaCl ,100mmol/L Na 22ED 2TA ,100mmol/L Tirs ,p H 10;临用前加入1%Tri 2ton X -100和10%DMSO )于4℃暗盒进行细胞裂解1h 20min 。经0.4mol/L Tris 缓冲液漂洗后浸入电泳液(30mmol/L NaOH ,1mmol/L Na 22ED 2TA ,p H 13)于4℃暗盒进行DNA 双链解旋20min ,电泳(18V ,70mA )30min 。

阅片　经0.4mol/L Tris 缓冲液中和后,在胶

1

13　复旦学报(医学版)

Fudan Univ J Med Sci 2004May ,31(3)

上滴加溴化乙锭(EB ,15μg/mL ),每孔约5μL ,于

4℃暗盒染色10min 。用滤纸吸去载胶片上过多液体后,置荧光显微镜下观察和图像采集(Nikon DXM 1200)。

结 果

载胶片上单层灌胶后产生的凝胶胶面平整,操作结束无胶落(图1)。DNA 分子经EB 染色后,在紫外线照射下呈红色。对照组DNA 分子聚集在细胞核,电泳图像清晰,而6Gy 照射后产生的DNA 碎片经电泳扩散形成“彗星尾”状影像,

形态特征明显(图2)。

图1　聚苯乙烯孔槽上的凝胶胶面

Fig 1　Photographs of polystyrene ponds with gel

图2　碱性单细胞凝胶电泳

Fig 2　T ypical images of alkali single cell gel electrophoresis

A :Untreated human blood lymphocytes ;

B :Human blood lymphocytes exposed to 6Gy of γrays

讨 论

ASCGE 技术自Singh 等[1]建立以来,被广泛应用于电离辐射、紫外线和氧化以及化学药物引起的DNA 损伤检测,其操作规范已引起广泛重视[2]。近年来尽管已在制胶等各方面进行不断改进[3,4],如由传统的磨毛载玻片上铺3层凝胶的“夹心法”改进为2层或单层灌胶法,但胶板易损坏和胶落的问题仍没有得到很好解决,并且操作步骤多、时间长,给该技术的规范和推广带来一定困难。实验失败的原因主要包括盖玻片揭取或推移时对凝胶板造成的撕裂或移动,强碱对玻璃表面的侵蚀作用和电泳过程产生的温度升高等,使胶与玻璃表面贴附不稳定,使

之在随后的浸入或取出操作时脱落或漂浮。碱与玻璃的反应产物可能也是胶中颗粒性杂质的主要来源。因此选择在碱性溶液中稳定的材料,避免盖玻片推移和减低电泳时温度等是必要的。

为此,我们根据聚苯乙烯材料性质稳定的特点,用96孔培养板盖来裁制载胶片,利用孔凸边形成的圆形凹槽进行单层铺胶,基本克服以上缺点。胶片大小可根据需要来定,一般接近载玻片大小易于观察操作,如25mm ×68mm 或35mm ×68mm 大小,可有2或3列共16或24孔供分组选用,其中两端各1行不灌胶,更于夹取和标记。铺胶时将37℃保温的1%LMA 凝胶按3∶1比例加入细胞悬液,轻轻打匀后平铺入孔内,每孔灌胶15～20μL ,可形成直径9mm 厚约0.2～0.3mm 的0.75%胶板,一般灌胶18μL 形成的胶面较平整,载胶片预温有利于

胶板牢固贴附。

我们采用该聚苯乙烯孔槽单层铺胶的制胶方法缩短了铺胶过程,制成的胶面平整,在随后的裂解、电泳和中和等操作过程中无脱落。观察时减少了杂质干扰,DNA 电泳图像清晰。6Gy 照射产生的“彗星”形态特征清楚典型,与传统方法一致[5,6]。同时铺制的胶板大小一致,裂解、电泳和中和等操作的条件相同,单片上分组选择多,从而提高了各组数据的可比性,尤其适合普查等多样品分析使用。

参　考　文　献

1　Singh NP ,Mccoy MT ,Tice RR ,et al .A simple technique for quan 2titation of low levels of DNA damage in individual cells.Ex p Cell

Res ,1988,175:184

2　Hartmann A ,Agurell E ,Beevers C ,et al .Recommendations for con 2ducting the i n vivo alkaline Comet assay.4th International Comet Assay Workshop.M utagenesis ,2003,18(1):45

3　张遵真,衡正昌,李蕊,等.单细胞凝胶电泳试验的最适条件研究.

卫生毒理学杂志,1998,12(4):249

4　张建平,田源,陈道达.单细胞凝胶电泳制胶方法的改进.癌变畸

变突变,1998,10(3):189

5　Olive PL ,Frazer G ,Banath J P.Radiation 2induced apoptosis measured

in TK6human B lymphoblast cells using the comet assay.Radiat

Res ,1993,136:130

6　张军宁,洪承皎,朱寿彭.单细胞凝胶电泳检测外照射诱导DNA

单链断裂和双链断裂.辐射研究与辐射工艺学报,2002,20(3):

220

(收稿日期:2003-09-16)(编辑:张秀峰)

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