固定化酶与固定化细胞

固定化酶

水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。在催化反应中以固相状态作用于底物。

固定化酶（immobilized enzyme），酶本身还是溶于水的，只是是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产，但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间。

酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。

固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。

物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。

化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过

酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法. 其中吸附法和共价键法又可统称为载体结合法。

具体方法

吸附法

利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。

常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。

采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。

载体结合法

最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。以中国首先采用的双功能团试剂“对位-β-硫酸酯乙砜基苯胺”偶联载体和酶为例，载体结合的步骤如下页反应式。

此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。此外酶通过物理吸附或离子吸附于载体制备固定化酶也是常用的方法。

交联法

依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。

包埋法

酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。

酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍（如5′-磷酸二酯酶的工业应用）甚至几百倍（如青霉素酰化酶的工业应用）。

固定化细胞

固定化细胞是指固定在水不溶性载体上，在一定的空间范围进行生命活动（生长、繁殖和新陈代谢等）的细胞。它是用于获得细胞的酶和代谢产物的一种方法，起源于20世纪70年代，是在固定化酶的基础上发展起来的新技术。由于固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。通过各种方法将细胞和水不溶性载体结合，制备固定化细胞的过程称为细胞固定化。

微生物细胞、动物细胞、植物细胞都可以制成固定化细胞。

细胞的种类多种多样，大小和特性个不相同，故此细胞固定化的方法有很多种。归结起来，主要可以分为吸附法和包埋法两大类。

1.吸附法

利用各种吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定的方法称为吸附法。

用于细胞固定化的吸附剂主要有硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体、和中空纤维等。

酵母细胞带有负电荷，在pH3~5的条件下能够吸附在多空陶瓷、多空塑料等载体的表面，制成固定化细胞，用于酒精和啤酒等的发酵生产；在环境保护领域内使用的活性污泥中含有各种各样的微生物，这些微生物可以沉积吸附在硅藻土、多孔玻璃、多孔陶瓷、多空塑料等载体的表面，用于各种有机废水的处理，降低废水中的化学需氧量（COD)和生化需氧量（BOD）；各种霉菌会长出菌丝体，这些菌丝体可以吸附缠

绕在多空塑料、金属丝网等载体上用于生产有机酸和酶等；植物细胞可吸附在中空纤维外壁，用于生产色素、香精、药物和酶等次级代谢产物；动物细胞大多属于贴壁细胞，必需依附在固体表面才能正常生长，故可吸附在容器壁、微载体、中空纤维外壁等载体上，制成固定化细胞，用于各种蛋白质的生产。

2.包埋法

将细胞包埋在多空载体内部而制成固定化细胞的方法称为包埋法。包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。

凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定方法。

1．5．1无载体的固定

无载体固定主要目的是将吸附或者共价交联的细胞，彼此分成自身独立

的区域。所谓吸附过程是指细胞发酵过程中产生的细胞体絮凝或者呈丸粒状；或通过二级过程，在适应的参数变化之下，简单有效地制各出具有触媒活性的颗粒。

在此过程中。往往加入少量絮凝剂(即聚合物)，加入的聚合物可直接参与细胞间的相互作用。其明显特征是颗粒牢固。

1．5．2预制载体的固定

在酶的固定化领域中，尤其是使用共价结合是一种典型的方法。这一方法也可适用于固定化细胞的操作。触媒制备过程中形成的载体本体应不受物理、化学的条件限制。因此载体物质的柔性与制作方法要求很高。在制作过程中最优化的机械性能、孔隙结构受生理参数约束。

1．5．3载体制备过程中的固定

此法为整体细胞固定的一种通用方法。该工艺主要包括截留与密封。其实密封是一种边际效应。此法的特点是：由于整个细胞大小，制成的网状体比较简单，它能全面封锁滞留细胞，并对输送基质与产品有足够快的高效酶活；由于制备载体与保留酶活性及细胞存活生理要求条件适合，故载体制备的主要问题已得到解决。1．5．4生物触媒内固定化细胞的生长

此法正因其日趋重要而引起人们的注意。其理由是：整个细胞体处于存活状态下。制成生物触媒时，在小球之内，它的细胞浓度很可能增加和提高。新制各的生物触媒或者一级与多级酶系统生物触媒，经再生利用都可能出现一定程度的失活。而置入适当的生长环境下培养，其细胞浓度可能又会增加。最后，活细胞生物触媒或在静止期、或在生长期，作为多酶系统或辅酶系统的提供者，而得到利用。