土壤中提取放线菌

一、实验目的：

1．掌握配置合成培养基的一般方法

2．掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的原理与方法

3．掌握放线菌的染色及制片方法

4．了解放线菌的结构特点，并能够加以区分

二、实验原理：

（一）、综述：

放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。

（二）、菌落特征：

放线菌的菌落由菌丝体组成。一般圆形、光平或有许多皱褶，光学显微镜下观察，菌落周围具辐射状菌放线菌丝。总的特征介于霉菌与细菌之间，因种类不同可分为两类：一类是由产生大量分枝和气生菌丝的菌种所形成的菌落。链霉菌的菌落是一类型的代表。链霉菌菌丝较细，生长缓慢，分枝多而且相互缠绕，故形成的菌落质地致密、表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱，菌落较小而不蔓延；营养菌丝长在培养基内，所以菌落与培养基结合较紧，不易挑起或挑起后不易破碎：当气生菌丝尚未分化成孢子丝以前，幼龄菌落与细菌的菌落很相似，光滑或如发状缠结。有时气生菌丝呈同心环状，当孢子丝产生大量孢子并布满整个菌落表面后，才形成絮状、粉状或颗粒状的典型的放线菌菌落；有些种类的孢子含有色素，使菌落有面或背面呈现不同颜色，带有泥腥味。

另一类菌落由不产生大量菌丝体的种类形成，如诺卡氏放线菌的菌落，粘着力差，结构呈粉质状，用针挑起则粉碎。若将放线菌接种于液体培养基内静置培养，能在瓶壁液面处形成斑状或膜状菌落，或沉降于瓶底而不使培养基混浊；如以震荡培养，常形成由短的菌丝体所构成的球状颗粒。

（三）、形态与结构：

1．菌丝（mycelium）：放线菌种类很多，多数放线菌具有发育良好的分支状菌丝体，少数为杆状或原始丝状的简单形态。菌丝大多无隔膜，其粗细与杆状细菌相似，直径为1微米左右。根据菌丝的着生部位、形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三种。

（1）．基内菌丝(substrate mycelium) ：又称初级菌丝或者营养菌丝.色淡，主要功能是吸收营养物质和排泄代谢产物。可产生黄、蓝、红、绿、褐和紫等水溶色素和脂溶性色素，色素在放线菌的分类和鉴定上有重要的参考价值。放线菌中多数种类的基内菌丝无隔膜，不断裂，如链霉菌属和小单孢菌属等；但有一类放线菌，如诺卡氏菌型放线菌的基内菌丝生长一定时间后形成横隔膜，继而断裂成球状或杆状小体。

（2）．气生菌丝（aerial mycelium）：是基内菌丝长出培养基外并伸向空间的菌丝，又称二级菌丝。在显微镜下观察时，一般气生菌丝颜色较深，比基内菌丝粗，长度相差悬殊，形状直伸或弯曲，可产生色素，多为脂溶性色素。

（3）．孢子丝（spore hypha）：是当气生菌丝发育到一定程度，其顶端分化出的可形成孢子的菌丝，叫孢子丝，又称繁殖菌丝.放线菌孢子丝的形态及其在气生菌丝上的排列方式，随菌种不同而异，是链球菌菌种鉴定的重要依据。孢子丝的形状有直形、波曲、钩状、螺旋状.螺旋状的孢子丝较为常见，其螺旋的松紧、大小、螺数和螺旋方向因菌种而异。孢子丝的着生方式有对生、互生、丛生与轮生等多种。

2．孢子（spore）：孢子丝发育到一定阶段便分化为孢子。在光学显微镜下，孢子呈圆形、椭圆形、杆状、圆柱状、瓜子状、梭状和半月状等，即使是同一孢子丝分化形成的孢子

也不完全相同，因而不能作为分类、鉴定的依据。孢子的颜色十分丰富。

3．孢囊：生孢囊放线菌的特点是形成典型孢囊，孢囊着生的位置因种而异。有的菌孢囊长在气丝上，有的菌长在基丝上。孢囊外围都有囊壁，无壁者一般称假孢囊。孢囊有圆形、棒状、指状、瓶状或不规则状之分。孢囊内原生质分化为孢囊孢子，带鞭毛者遇水游动，如游动放线菌属；无鞭毛者则不游动，如链孢囊菌属。

（四）、观察方法：

1．插片培养观察：将放线菌菌种制成孢子悬液后（浓度以10—2—10—3为好），取0.2ml 放在适合放线菌生长的平板培养基上，用玻璃刮铲涂布均匀，然后将灭过菌的盖玻片斜插入固体培养基中，置28—32℃下培养，3—5天后取出盖玻片放在载玻片上镜检，可见放线菌的自然生长的个体形态。

2．压片观察：取放细菌培养体一块，应带培养基，放在载玻片上，用另一载玻片对准菌块的气生菌丝轻轻按压，然后将载玻片垂直拿起。将印有放线菌的涂面朝上，通过酒精灯火焰2～3次加热固定。染色1min。水洗，晾干。

本次实验采用了压片观察

三、实验器材

试剂：10%酚、可溶性淀粉、硝酸钾、氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁、琼脂、草酸氨结晶紫

仪器：药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角烧瓶、培养皿、试管、棉花、纱布、接种环、接种针、载玻片、酒精灯、灭菌锅

四、实验过程

1．将自己所需的玻璃器皿包扎好，并灭菌

2．配置高氏1号固体培养基和生理盐水并装瓶和试管

3．采取土样→烘干并研磨→称取1g溶于99ml水配成0.01的溶液→摇晃20分钟，再静置→取上层菌液配成0.001、0.0001、0.00001三种溶液→各去1ml的0.001、0.0001、0.00001菌液加入培养皿