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其大小，常将不同的（ 10×、 20×、 40×、 100×）环状光栏与聚光器装在一起组成转
盘聚光器，转动聚光器可更换大小不同的
光栏。数字为“ 0” 时，表明无环状光栏， 为普通明视野观察孔
第四节 荧光显微镜
荧光显微镜的主要特点是观察的标本图
像，不是由于光源照明成像的结果，而是由
于标本内的荧光物质吸收光源而发出的激发 光光能，所呈现的荧光现象，如果停止照明 （停止供能），则荧光现象立即消失
光镜标本显微摄影技术
光镜标本显微图像处理与分析技术
第一章 光学显微镜
光学显微镜是观察生物有机体的微
细结构、组织和细胞内的物质分布及有 关细胞功能活动的精密仪器
显微镜的发展历史及应用成果
荷兰人（ Zacharias Janssen ） （1595年）发明第一台复式显微镜？
英国人Robert Hook（1665年） 第一次用最简单的显微镜观察生物样 品—软木切片，发现了一些锋窝样空 腔结构，并命名为“细胞”
（形态、机能）
生物光镜技术是生物医学研究中最常用手段之一
《生物光镜标本技术》希望能给大家对生物光镜 标本技术涉及的范围和常用的技术方法有个 初步了解，并对今后研究工作有所帮助
内
容
光学显微镜
光镜标本基本制作技术
光镜标本特殊染色技术
光镜标本组织化学技术
光镜标本免疫组织化学技术
光镜标本杂交组织化学技术
培养皿或培养瓶，还可以安装有机玻璃保
温罩和自动恒温调节器，直接观察体外培
养的细胞，以及对活细胞进行各种实验操
作及连续观察和拍摄电影
第三节 相差显微镜
相差显微镜是利用光的干涉和衍射作用，
使不染色标本中不同折光的部分变成明暗相差的
图像，因此可适用于观察体外培养的活细胞形态
结构及分裂增生和运动变化、染色标本中染色所
N.A=n*sin u
物镜分辨率（Z）是指能分辨物体两点间 最短距离的能力，与光波波长（λ）和数值孔 径（N.A）的关系 Z= 0.61 λ /N.A 可见光波波长平均为550nm，数值孔径一
般小于1，最大数值孔径为1.4，所以光镜最高
分辨率约为0.25μm
新的理论及技术使光学显微镜能超高分辨率！
荧光显微镜
激光扫描共聚焦显微镜 暗视野显微镜 偏光显微镜 多光子显微镜 原子力显微镜
微分干涉显微镜 扫描遂道显微镜 电子显微镜
第一节 普通光学显微镜
一、普通光学显微镜的原理及性能
二、普通光学显微镜的结构
(一) 机械部分
(二) 光学部分
三、光学显微镜技术指标
数值孔径（N.A）为物镜从物体吸收的光量， 取决于物体点到镜面边缘入射光束与物镜光轴之 间形成的角度（u）和光线通过介质的折射率（n）
不能显示的微细结构等
一、相差显微镜成像原理
基本原理涉及两个问题：光波的相位差 和光的干涉与衍射
相差显微镜的特点是改变光的相位，使
相位差变为振幅差，借此增强或减弱光的明 暗度而观察生活标本的微细结构
二、相差显微镜装置
增加部件：环状光栏、相位板和中心望远镜
环状光栏随物镜放大倍数的高低变更
德国植物学家Schleiden（1838年） 和动物学家Schwann（1839年）分别发现 植物和动物都是由细胞组成，建立了“细 胞学说” 德国病理学家Virchow（1856年）进
一步提出细胞是机体的结构和功能单位
显微镜的种类
普通光学显微镜 相差显微镜
倒置显微镜
透射式照明 落射式照明
五、光学显微镜使用和保养
第二节 倒置显微镜
倒置显微镜把光源和聚光器安装在显 微镜载物台的上方，物镜放置在载物台的 下方
配有附件：相差长焦距聚光器和物镜、
暗视野聚光器、荧光显微镜光源和滤片（激
发滤片和阻断滤片）以及电影摄像机等
显微镜特点：增大了物镜和聚光器的
工作距离，载物台可放置较高的标本，如
荧光也是一种光致发光的现象
释放出的荧光波长较激发光的长，如引
起荧光的最有效的光常是激光、紫外光和蓝
紫光，而产生的是红、橙、黄、绿、青、蓝、
紫色的荧光 荧光分自发性荧光（原发荧光、固有荧 光或自然荧光）和续发性荧光
二、荧光显微镜组成
（一）光源
荧光显微镜均附有高压汞灯和低压钨
丝或卤素灯两种光源。前者为荧光显微镜
光镜荧光图像分辨率受到衍射极限限制
激发的荧光 ~ 1 nm
物镜
衍射极限光点
Dr ~ 200 nm
放大率指最终成像与原物体的大小比值 总放大率=物镜线放大率×目镜角放大率
放大率受物镜分辨率的限制
景深（将焦点调在标本上的某一平
面时，能看清楚这一平面及其上下结构
的清晰部分的厚度）
视野范围
视野亮度
四、光学显微镜照明技术
激发滤片和阻断滤片的联合使用
一、荧光的产生
光的实质上是物质的原子或分子向外辐射 的一种可见的电磁波 当光进入某些物质后，部分或全部光能可 被此物质的分子或原子吸收 物质从外部吸收光能后，会进入新的状态， 称为“激发态”。而激发态属于不稳定状态， 所以物质会从激发态回到原来的基态，以电磁 辐射的形式放出所吸收的能量，这种现象叫做 “发光”
江苏省优秀研究生课程
生物光镜标本技术
南通大学医学院
组织学与胚胎学系
王 晓 冬
E-mail: wxdzw@ntu.edu.cn；QQ: 455606752 电话：0513-85051862 13773659801
2015年3月ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
目 的
不同层次的研究方法
（整体、器官、组织、细胞、分子）
不同学科的研究方法
光源，后者为进行普通标本观察时的照明
光源
（二）滤片系统
（三）显微镜
350
400 nm
457 488 514
500 nm
610
600 nm
Exciting Light
Fluroescence
Texas Red PI Ethidium PE FITC
激发滤片装在光源和标本之间的滤片滑板 中，其作用是吸收光源中波长较长的可见光， 允许短于一定波长的光波通过，作为荧光显微 镜的激发光 阻断滤片是装在物镜和目镜之间的光路滑 板中。吸收短于滤片标记数字的波长光，允许 长于标记数字的波长光通过。它的主要作用是 吸收视野内未被标本吸收的激发光，允许标本 内的物质发射的荧光通过，以获得清晰的荧光 图像和保护观察者的眼睛 吸热滤片 吸收紫外线滤片
盘聚光器，转动聚光器可更换大小不同的
光栏。数字为“ 0” 时，表明无环状光栏， 为普通明视野观察孔
第四节 荧光显微镜
荧光显微镜的主要特点是观察的标本图
像，不是由于光源照明成像的结果，而是由
于标本内的荧光物质吸收光源而发出的激发 光光能，所呈现的荧光现象，如果停止照明 （停止供能），则荧光现象立即消失
光镜标本显微摄影技术
光镜标本显微图像处理与分析技术
第一章 光学显微镜
光学显微镜是观察生物有机体的微
细结构、组织和细胞内的物质分布及有 关细胞功能活动的精密仪器
显微镜的发展历史及应用成果
荷兰人（ Zacharias Janssen ） （1595年）发明第一台复式显微镜？
英国人Robert Hook（1665年） 第一次用最简单的显微镜观察生物样 品—软木切片，发现了一些锋窝样空 腔结构，并命名为“细胞”
（形态、机能）
生物光镜技术是生物医学研究中最常用手段之一
《生物光镜标本技术》希望能给大家对生物光镜 标本技术涉及的范围和常用的技术方法有个 初步了解，并对今后研究工作有所帮助
内
容
光学显微镜
光镜标本基本制作技术
光镜标本特殊染色技术
光镜标本组织化学技术
光镜标本免疫组织化学技术
光镜标本杂交组织化学技术
培养皿或培养瓶，还可以安装有机玻璃保
温罩和自动恒温调节器，直接观察体外培
养的细胞，以及对活细胞进行各种实验操
作及连续观察和拍摄电影
第三节 相差显微镜
相差显微镜是利用光的干涉和衍射作用，
使不染色标本中不同折光的部分变成明暗相差的
图像，因此可适用于观察体外培养的活细胞形态
结构及分裂增生和运动变化、染色标本中染色所
N.A=n*sin u
物镜分辨率（Z）是指能分辨物体两点间 最短距离的能力，与光波波长（λ）和数值孔 径（N.A）的关系 Z= 0.61 λ /N.A 可见光波波长平均为550nm，数值孔径一
般小于1，最大数值孔径为1.4，所以光镜最高
分辨率约为0.25μm
新的理论及技术使光学显微镜能超高分辨率！
荧光显微镜
激光扫描共聚焦显微镜 暗视野显微镜 偏光显微镜 多光子显微镜 原子力显微镜
微分干涉显微镜 扫描遂道显微镜 电子显微镜
第一节 普通光学显微镜
一、普通光学显微镜的原理及性能
二、普通光学显微镜的结构
(一) 机械部分
(二) 光学部分
三、光学显微镜技术指标
数值孔径（N.A）为物镜从物体吸收的光量， 取决于物体点到镜面边缘入射光束与物镜光轴之 间形成的角度（u）和光线通过介质的折射率（n）
不能显示的微细结构等
一、相差显微镜成像原理
基本原理涉及两个问题：光波的相位差 和光的干涉与衍射
相差显微镜的特点是改变光的相位，使
相位差变为振幅差，借此增强或减弱光的明 暗度而观察生活标本的微细结构
二、相差显微镜装置
增加部件：环状光栏、相位板和中心望远镜
环状光栏随物镜放大倍数的高低变更
德国植物学家Schleiden（1838年） 和动物学家Schwann（1839年）分别发现 植物和动物都是由细胞组成，建立了“细 胞学说” 德国病理学家Virchow（1856年）进
一步提出细胞是机体的结构和功能单位
显微镜的种类
普通光学显微镜 相差显微镜
倒置显微镜
透射式照明 落射式照明
五、光学显微镜使用和保养
第二节 倒置显微镜
倒置显微镜把光源和聚光器安装在显 微镜载物台的上方，物镜放置在载物台的 下方
配有附件：相差长焦距聚光器和物镜、
暗视野聚光器、荧光显微镜光源和滤片（激
发滤片和阻断滤片）以及电影摄像机等
显微镜特点：增大了物镜和聚光器的
工作距离，载物台可放置较高的标本，如
荧光也是一种光致发光的现象
释放出的荧光波长较激发光的长，如引
起荧光的最有效的光常是激光、紫外光和蓝
紫光，而产生的是红、橙、黄、绿、青、蓝、
紫色的荧光 荧光分自发性荧光（原发荧光、固有荧 光或自然荧光）和续发性荧光
二、荧光显微镜组成
（一）光源
荧光显微镜均附有高压汞灯和低压钨
丝或卤素灯两种光源。前者为荧光显微镜
光镜荧光图像分辨率受到衍射极限限制
激发的荧光 ~ 1 nm
物镜
衍射极限光点
Dr ~ 200 nm
放大率指最终成像与原物体的大小比值 总放大率=物镜线放大率×目镜角放大率
放大率受物镜分辨率的限制
景深（将焦点调在标本上的某一平
面时，能看清楚这一平面及其上下结构
的清晰部分的厚度）
视野范围
视野亮度
四、光学显微镜照明技术
激发滤片和阻断滤片的联合使用
一、荧光的产生
光的实质上是物质的原子或分子向外辐射 的一种可见的电磁波 当光进入某些物质后，部分或全部光能可 被此物质的分子或原子吸收 物质从外部吸收光能后，会进入新的状态， 称为“激发态”。而激发态属于不稳定状态， 所以物质会从激发态回到原来的基态，以电磁 辐射的形式放出所吸收的能量，这种现象叫做 “发光”
江苏省优秀研究生课程
生物光镜标本技术
南通大学医学院
组织学与胚胎学系
王 晓 冬
E-mail: wxdzw@ntu.edu.cn；QQ: 455606752 电话：0513-85051862 13773659801
2015年3月ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
目 的
不同层次的研究方法
（整体、器官、组织、细胞、分子）
不同学科的研究方法
光源，后者为进行普通标本观察时的照明
光源
（二）滤片系统
（三）显微镜
350
400 nm
457 488 514
500 nm
610
600 nm
Exciting Light
Fluroescence
Texas Red PI Ethidium PE FITC
激发滤片装在光源和标本之间的滤片滑板 中，其作用是吸收光源中波长较长的可见光， 允许短于一定波长的光波通过，作为荧光显微 镜的激发光 阻断滤片是装在物镜和目镜之间的光路滑 板中。吸收短于滤片标记数字的波长光，允许 长于标记数字的波长光通过。它的主要作用是 吸收视野内未被标本吸收的激发光，允许标本 内的物质发射的荧光通过，以获得清晰的荧光 图像和保护观察者的眼睛 吸热滤片 吸收紫外线滤片