PCR检测常见问题与解决途径

PCR检测常见问题与解决途径

利用PCR方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。一个好的PCR 方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。

本文对PCR检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。

一、假阳性：

（一）假阳性现象

假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。

（二）造成假阳性的原因

1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；

2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。

4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。

5. 实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题比较常见。

（三）假阳性问题的试验控制

在每次PCR检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明DNA提取（RNA提取、RNA反转录）、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。只有设立试验全程的对照，才能证明试验结果成立。

造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。试验对照包括：

1、DNA阳性对照：以含有目的片段的DNA(或质粒）作为模板进行扩增，证明PCR试剂是否有效、扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段。（注意：阳性样品扩增效率高，应严格控制，避免其成为潜在的污染源）。

2、DNA阴性对照：以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。

3、空白对照：以纯水作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。

4、PCR抑制物对照：在与阳性对照相同的反应体系中，加入相同数量的待测样品DNA，如果未扩增出目的片段，证明此待测样品DNA中存在PCR抑制物。

5、空白提取对照：空白提取对照扩增结果为阳性，说明DNA提取试剂可能受到污染。

6、阳性提取对照：阳性提取对照扩增结果为阴性，说明提取过程可能有误。

如果DNA阳性对照扩增结果为阴性，或者DNA阴性对照和空白对照扩增结果为阳性，则说明PCR试剂或扩增过程存在问题。

（四）假阳性解决途径

由于PCR 的敏感性和效率特别高，所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现假阳性。尤其是PCR扩增产物和质粒分子很容易造成实验室的污染，导致假阳性现象发生。

1、规范实验室设计

实验室设置上分配液区、DNA提取区、扩增区、电泳区。物流应按分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区顺序，严禁倒流。在连续而独立的空间中完成不同实验步骤。不同工作区域相互隔离，通过传递仓传递。

PCR前处理区（样品制备室、DNA提取室）和PCR准备室设置正压通风系统，并设置通风柜或生物反应柜造成局部负压；后PCR室（PCR室及电泳室为高度污染区）设置负压通风系统，防止大量游离分子及气溶胶，对其它区域造成环境污染。

配制PCR反应体系（配备冰箱及生物安全柜，此实验室要求无模板DNA 存在）和向PCR反应体系中加入模板DNA（配备生物安全柜及冰箱）要求在不同区域进行。

2、规范试剂耗材管理

1）验证：新购买的试剂需进行实验前验证；

2）分装：双蒸水、引物和dNTP均应分装储存，并标明日期，以防污染；试剂的分装应在装有紫外灯的超净工作台上进行；试剂分装成小份一次使用后弃去。

3）消毒：除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。必要时，在加样本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

3、规范实验室操作

1）控制污染源：PCR产物和质粒操作空间是最大的污染源，应严格防止将这个空间的物品带出；

2）一次性用具：使用实验服和一次性手套，使用带有滤膜的移液器枪头，一次性反应管和离心管；

3）定期消毒：定期对实验室进行紫外照射，用10%漂白剂、3％双氧水或专用商业产品清理实验室台面及死角。

4）定期通风：对实验室定期进行正压、负压通风处理；

5）小心操作：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；加样时，最后加阳性对照。

4、技术处理

1）在DNA 模板和多聚酶加入前，紫外线照射反应管内容物以破坏污染的PCR 产物。一般选用波长254nm 照射30min （Nature ，1990 ，34:27 ）；

2）PCR 实验中使用dUTP ，而不用dTTP 。在扩增前使用UraciI N 一g1ycosylase （尿嘧啶糖基化酶）处理可降解交叉污染的PCR 产物，而不降解基困组DNA 模板，然后热灭活此酶，再进行扩增反应（Gene，1990，93：125）。美国PE 公司提供此类试剂盒；