特殊染色

43、组织中铁质的显色法
44、组织中铜的显色法
罗丹明染色法
1、[试剂配制]：（1）DMAB-罗丹明贮备液：对二甲氨基苄罗丹明饱和于无水乙醇中，贮存液4℃保存。

（2）DMAB-罗丹工作液（充分摇动）：DMAB-罗丹明贮备液3ml，蒸馏水47ml，使用前现配现用。

2、[染色步骤]：（1）切片脱蜡至蒸馏水。

（2）用DMAB-罗丹明液60℃染色3小时（1小时后显微镜下检查）。

（3）用蒸馏水冲洗。

（4）对比染色（颜色要浅些）用苏木精染5秒。

（5）盐酸乙醇分化。

（6）流水冲洗5分钟。

（7）脱水，透明，风骨。

3、[结果]：铜沉积物-砖红色，核-蓝色，胆汁-绿色。

Timm's铜染色法
1、[试剂配制]：（1）液体A：5%硝酸银水溶液，液体B：对苯二酚
2.0g，柠檬酸5.0g，蒸馏水100ml，液体可以贮存在4℃暗处一个月。

2、[染色步骤]：（1）石蜡切片脱蜡至水。

（2）0.5%硫化铵5min （3）充分水洗。

（4）用0.1N盐酸2-3min祛除铁和硫化锌液(15%三氯醋酸也可以使用)。

（5）水洗。

（6）切片置新鲜1份A液和5份B液过滤后使用，将硫化铜转化为硫化银3min就可以完成。

（7）水洗。

（8）脱水，透明，封固。

3、[结果]：铜沉积物被染成黑色。

Howell氏红氨酸铜的显示法
1、[固定]：10%甲醛液（体内与蛋白质相结合的铜损失较少），亦可用无水酒精溶液固定。

2、[试剂]：红氨酸染液：0.1%红氨酸无水酒精溶液 5ml，10%醋酸钠溶液 100ml，70%酒精溶液。

3、[操作步骤]：（1）石蜡切片脱蜡至水。

（2）红氨酸染液37℃12~24小时。

（3）70%酒精溶液换洗2次，15~30分钟。

（4）无水酒精溶液6小时至过夜（可加入醇性伊红复染）。

(5)脱水、透明、封固。

4、[结果]：铜呈绿黑色颗粒；背景呈粉红色。

45、组织中铅的显色法：Mallory-Parker氏铅的显示法
1、[固定]：10%甲醛液。

2、[试剂]：0.1%美蓝酒精（20%）溶液
3、[操作步骤]：（1）石蜡切片脱蜡至水。

（2）0.1%美蓝酒精染液内10~20分钟。

（3）95%酒精溶液分化。

（4）脱水、透明、封固。

4、[结果]：铅呈深蓝色；铜呈淡蓝色。

46、组织中砷的显色法：Castel氏砷的显示法
1、[固定]：10%甲醛液。

2、[试剂]：硫酸铜-甲醛液：硫酸铜 2.5g，10%甲醛溶液 100ml，1%番红花溶液；
3、[操作步骤]：（1）组织在硫酸铜-甲醛液内5天。

（2）流水洗涤24小时。

（3）脱水、透明、石蜡包埋。

（4）石蜡切片脱蜡至水。

（5）1%番红花溶液作对比染色。

（6）脱水、透明、封固。

4、[结果]：组织中的砷呈绿色颗粒状。

47、组织中尿酸盐显色法：Gomori-Burtner氏六胺银染色法
1、[组织固定]：信息组织块无水乙醇固定24h，更换2-3次新液，以后用无水酒精脱水、二甲苯透明，石蜡包埋。

2、[试剂配制]：六胺银原液：5%硝酸银水溶液5ml，3%鸟罗托品水液100ml，两液混合发生白色沉淀，震荡后溶解而澄清，该液置冰箱后能放数月。

六胺银染液：六胺银原液30ml，硼酸-硼酸盐缓冲液（PH7.8）8ml。

硼酸-硼酸盐缓冲液（PH7.8）M/5硼酸溶液16ml，M/20四硼酸钠溶液4ml。

3、[操作步骤]：（1）石蜡切片5-7μm，漂浮于95%酒精液上，稍加温展平切片，并粘贴在玻片上，然后置37℃烤箱内烘干。

（2）汽油脱蜡，并用无水酒精洗涤。

（3）切片置于37℃温箱内用六胺银染色，染20-60分钟，镜检尿酸盐沉淀变为黑色为止。

（4）5%硫代硫酸钠处理2-3分钟。

（5）蒸馏水洗。

（6）用0.5%伊红酒精溶液1分钟。

（7）无水酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封固。

4、[结果]：尿酸盐结晶体黑色，其他组织呈复杂的颜色。

48、组织中脂类物质染色：苏丹-Ⅲ染色法
1、[ 与染色相关的问题]: (1)在石蜡包埋组织处理过程中,要用一些有机溶剂，所以石蜡切片不能用于脂类染色，通常用冰冻切片或炭蜡包埋切片。

切片厚5～15微米。

(2)切片选用中性甲醛、钙甲醛或锇酸固定液固定。

单纯甲醛固定会丢失一些磷质。

脂类物质不溶于水，易溶于有机溶剂。

所以显示脂质时不能用含有有机溶剂的固定液固定。

2、[配制]：苏丹-Ⅲ 0.15g，60-70%酒精 100ml，将染料溶于60-70%酒精中，临用前过滤。

密闭保存。

3、[染色步骤]: (1) 冰冻切片5-10微米。

漂于水中或粘贴在载玻片上。

(2) 蒸馏水洗。

(3) Harris苏木精液 1 min。

(4) 水洗3-5min。

(5) 蒸馏水洗。

(6) 70%酒精迅速洗,约20-30秒。

(7) 苏丹-Ⅲ液置于56℃温箱内浸染 30 min。

(8) 70%酒精分化数秒。

(9) 切片入蒸馏水。

(10) 用滤纸吸干切片上的水分，待干。

(11) 甘油明胶封固。

4、[结果]：脂类物质呈红色,细胞呈蓝色，粘液物质染色。

49、组织中胆固醇及胆固醇酯的显色法
50、组织中磷脂的显色法：Beker氏染色法
1、[固定]：10%甲醛-钙溶液固定6~12小时，移入新鲜的后铬化液18小时/室温，入新鲜的后铬化液中60℃，24小时，流水洗过夜，冰冻切片10μm。

2、[试剂]：后铬化溶液：重铬酸钾 5g，氯化钙 1g，蒸馏水 100ml，酸性苏木因溶液：苏木因 5g，1%碘酸钠 1ml，蒸馏水 48ml，硼砂-铁氰酸盐溶液：铁氰化钾 2.5g，四硼酸钠 2.5g，蒸馏水 100ml。

3、[操作步骤]：（1）冰冻切片入后铬化液60℃，1小时；蒸馏水充分洗。

（2）酸性苏木因溶液37℃染5小时。

（3）硼砂-铁氰酸盐溶液37℃分化18小时。

（4）自来水洗10分钟；甘油明胶封固。

[结果] 磷脂质呈暗蓝色。

51、胆色素显色法
Gmelin氏反应
1、[固定]： 10%甲醛固定液。

2、[试剂] ：50%硝酸水溶液
3、[操作步骤]：（1）石蜡切片脱蜡至水。

（2）盖上盖玻片，镜下找到色素所在处。

（3）用吸管将50%硝酸水溶液从盖玻片的一边滴入，并用吸水纸由另一边吸去。

（4）在镜下观察色素颜色的改变。

4、[结果]：阳性反应：颜色由黄色变呈绿色，后转变呈蓝色至紫色。

Stein氏胆红质反应
1、[固定]：10%甲醛固定液。

2、[试剂]：碘试剂处理溶液：Lugol氏碘液 30ml，碘酊溶液 10ml 5%次亚硫酸钠水溶液，明矾-胭脂溶液：胭脂 1g，铵明矾 2.5g ，蒸馏水 100ml，（混合煮沸10分钟，冷却后过滤）。

3、[操作步骤]：（1）石蜡切片脱蜡至水。

（2）碘试剂处理液6—12小时。

（3）5%次亚硫酸钠水溶液15—30分钟，水洗。

（4）丙酮脱水，二甲苯透明，树胶封固。

4、[结果]：胆红质呈绿色。

Fouche氏胆红质反应
1、[固定]：10%甲醛固定液。

2、[试剂]：氯化铁溶液：10%氯化铁水溶液 10ml，三氯醋酸溶液 25ml 蒸馏水 100ml。

3、[操作步骤]（1）石蜡切片脱蜡至水。

（2）新配制的氯化铁溶液5分钟。

（3）水洗，蒸馏水洗。

（4）VG对比染色5分钟。

（5）95%酒精溶液洗。

（6）纯酒精脱水，透明，封固。

4、[结果]：胆红质呈绿色。

Hall氏改良法
1、[固定]：10%甲醛固定液。

2、[试剂]：Fouchet氏试剂：25%三氯醋酸水溶液 100ml，10%三氯化铁水溶液 100ml，（临用时混合过滤），Van Gieson氏苦味酸-酸性复红溶液。

3、[操作步骤]：（1）石蜡切片脱蜡至蒸馏水。

（2）Fouchet氏试剂内媒染5分钟。

（3）自来水洗涤。

（4）Van Gieson氏苦味酸-酸性复红溶液中染1~5分钟。

（5）95%酒精溶液分化30秒钟。

（6）无水酒精脱水、透明、封固。

4、[结果]：胆红素被氧化胆绿色呈绿色（根据胆红素的浓度呈现不同程度的翡翠绿色至深绿色）；背景呈VG对比染色的色泽。

Van Gieson氏法
1、[固定]：10%甲醛，Zenker氏液，酒精等。

2、[试剂]：Van Gieson氏染液： 1%酸性品红液 10ml，苦味酸饱和液（约1.22%） 90ml，（分瓶盛放，临用前按比例混合），Weigert 氏铁苏木。

3、[操作步骤]：（1）石蜡切片脱蜡至水。

（2）Weigert氏铁苏木内染5—10分钟。

（3）自来水充分冲洗。

（4）Van Gieson氏液内30—60
秒钟。

（5）蒸馏水速洗，用滤纸吸干（或从染色液内将切片取出，直接用95%洒精分化数秒)。

（6）常规脱水、透明、封固。

4、[结果]：胆色素呈鲜艳的绿色。

Glenner氏三色法
1、[固定]：10%甲醛溶液，新鲜冰冻切片10μm。

2、[试剂]：2%铁氢化钾水溶液，醋酸-铁氢化钾溶液：5%醋酸溶液10ml，2%铁氢化钾溶液 10ml，（临用配制），3%重铬酸钾水溶液，油红O异丙醇液：0.5%油红-异丙醇溶液 6ml，蒸馏水 4ml，（临用配制、过滤、30分钟内尚可使用）。

60%酒精溶液或60%磷酸三乙酯溶液
3、[操作步骤]：（1）切片入蒸馏水洗涤。

（2）2%铁氢化钾水溶液5分钟。

（3）醋酸-铁氢化钾溶液浸染20分钟。

（4）自来水洗涤。

（5）3%重铬酸钾水溶液15分钟。

（6）蒸馏水洗涤。

（7）油红O-异丙醇溶液染10分钟。

(8)60%酒精溶液分化15~30秒钟。

(9)蒸馏水洗涤。

(10)甘油明胶封固。

4、[结果]：含铁血黄素呈蓝色；胆红素呈深鲜绿色；脂褐素呈深橙红色。

52、组织中DNA和RNA的显色法
53、AgNOR染色法
1、[取材与固定]:宫颈刮片、尿液离心涂片用95%乙醇或10%福尔马林固定15-30min。

2、[染色步骤]:(1) 宫颈刮片（涂片）蒸馏水充分洗3-4次。

(2) 浸入酸化液（36%冰醋酸1份无水乙醇3份）5-7 min。

(3) 蒸馏水洗
3-4次。

(4) 胶银液（A液：明胶2g溶于1%甲酸水溶液 B液：50%
硝酸银液过滤使用前A液1份B液2份混均后使用）20℃ 20-30min。

(5) 5%硫代硫酸钠水溶液1-2min。

(6) 蒸馏水洗3-4次。

(7) 乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

3、[结果观察]:组织背景呈淡黄色，高倍镜镜检胞浆不着色。

Ag-NOR 位于细胞核及核仁的阳性颗粒呈棕黑色。

选择无重叠、清晰的区域，随机选取50-100个细胞用油镜观察并计数Ag-NOR颗粒的数量。

根据每例中的Ag-NOR颗粒总数，再换算为每个细胞核中所含该颗粒的平均数。

根据数量，形态，大小及染色的深、浅等变化判断病变程度。

一般正常细胞中Ag-NOR颗粒平均数为1%-2%颗粒细小、均匀，染色适中。

恶性肿瘤细胞核及核仁中的Ag-NOR颗粒平均数达4%以上，且颗粒粗大浓染并密集成块状。

交界性病变（癌前期病变）平均数为2.5%-4%±。

颗粒比正常细胞的稍大，数量增多，呈圆形或卵园形，染色较深。

Ag-NOR颗粒的数量，大小和形态变化随病变程加重而改变。

数量和大小呈正比。

54、碱性磷酸酶的显色法：
Gomori氏碱性磷酸酶反应法
1、[固定]：新鲜组织以冷丙酮于4℃固定汇24小时，更换2—3次液体；再入室温新换丙酮脱水1小时；二甲苯透明，以56℃溶点石蜡浸蜡包埋；切片6—8μm，37℃烤1—2小时。

2、[试剂]：基质混合液：2%β-甘油磷酸钠水溶液 10ml，2%巴比妥钠水溶液 10ml，蒸馏水 20ml，2%氯化钙水溶液 2ml，2%硫酸镁水溶液 1ml，2%硝酸钴水溶液，黄色硫化铵稀溶液。

3、[操作步骤]：（1）石蜡切片脱蜡至蒸馏水。

（2）浸入基质混合液于37℃15分钟—16小时。

（3）蒸馏水快洗。

（4）2%硝酸钴水溶液作用3—5分钟。

（5）蒸馏水洗2—3次。

（6）硫化铵稀溶液作用1—3分钟。

（7）流水冲洗。

(8)常规脱水，透明，封固。

4、[结果]：碱性磷酸酶活动处呈黑色或棕黑色颗粒状或团块状。

碱性磷酸酶偶氮染色法
1、[固定]：新鲜组织以冷丙酮于4℃固定汇24小时，更换2—3次液体；再入室温新换丙酮脱水1小时；二甲苯透明，以56℃溶点石蜡浸蜡包埋；切片6—8μm，37℃烤1—2小时。

或新鲜及10%冷甲醛溶液固定组织冰冻切片。

2、[试剂]：基质液：磷酸a-荼酚钠 10-20mg，坚牢兰RR或坚牢黑
B 20mg，Miahaelos氏缓冲液 20ml，（临用前配制，对照试验免加第一种试剂），Miahaelos氏缓冲液: 醋酸钠 1.943g，巴比妥钠 2.943g 蒸馏水 1000ml。

3、[操作步骤] ：（1）石蜡切片脱蜡至蒸馏水。

（2）于基质液（过滤）浸染室温作用冰冻切片30—60分钟，石蜡切片4小时，自来水洗2—3分钟。

（3）苏木精复染细胞核，自来水洗15分钟。

（4）甘油明胶封固。

4、[结果]：碱性磷酸酶活动处呈黑色；细胞核呈淡蓝色。

Gossrau偶氮吲哚酚染色法
1、[固定]：冰冻切片4~6微米。

2、[试剂]：基质液： 5-溴-4氯-3吲哚磷酸甲苯胺盐 3mg，N-N二甲基甲酰胺液 0.05~0.15ml，0.2mol/LTris-HCL（pH9.2~9.4） 10ml 坚牢兰VB（或BB、RR） 10mg，（混合过滤），对照：去除底物或在基质液1~10mmol/l四唑。

3、[操作步骤] ：（1）冰冻切片。

（2）于基质液（过滤）37C5~30分钟。

（3）蒸馏水洗2—3分钟。

（4）4%甲醛固定10~60分钟。

（5）双蒸水洗15分钟。

（6）甘油明胶封固。

3、[结果]：酶的活性部位呈暗褐色（坚牢兰VB）、浅红褐色（坚牢兰BB）、兰色（坚牢紫B）。