酶活力测定方法的研究

实验二酶活力测定方法的研究（1）

——淀粉酶活性的测定

一、研究背景

酶Enzyme，指具有生物催化功能的高分子物质。酶通过降低化学反应的活化能来加快反应速率，因而具有高效性，同时酶具有高度的专一性。酶的催化活性可以受其他分子影响：抑制剂是可以降低酶活性的分子；激活剂则是可以增加酶活性的分子。酶的活性还可以被温度、化学环境（如pH值）、底物浓度以及电磁波（如微波）等许多因素所影响。酶在工业和人们的日常生活中的应用也非常广泛。例如，药厂用特定的合成酶来合成抗生素；加酶洗衣粉通过分解蛋白质和脂肪来帮助除去衣物上的污渍和油渍。

淀粉酶是一类水解淀粉的糖苷键的总称，按照其水解淀粉的方式，可以分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶是一种内切葡萄糖苷酶，催化水解α-1,4-糖苷键，生成α-麦芽糖和少量葡萄糖。β-淀粉酶从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1,4-葡聚糖链。对于象直链淀粉能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1,6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。

二、研究目标

1.掌握酶活力的测定方法

2.进一步学会设计实验方案

3.测定α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性

三、研究策略

酶的活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数。

实验的总体思路是测定每分钟内催化生成的麦芽糖的量。

1.酶的获取

淀粉酶广泛存在于禾谷物类的种子中α-淀粉酶是在萌发的过程中产生的。所以取萌发的种子浸提获取酶溶液。

2.反应过程

β-淀粉酶不耐热，在高温下容易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下发生钝化。尽管在种子的萌发过程中，提取液中同时含有两种淀粉酶，可利用这两种淀粉酶的不同特性加以处理，钝化其一，即可测定另外一种酶的活力。

3.产物的检测

淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用还原糖的3,5-二硝基水杨酸法测定。

四、研究方案及可行性分析

研究方案：

α-淀粉酶耐高温，而β-淀粉酶在高温下易失活。可以在适当的高温下水浴，使β-淀粉酶失去活性，而α-淀粉酶的活性不受很大的影响，这样分解的淀粉可以认为是α-淀粉酶催化的产物。同时可以测量α-淀粉酶和β-淀粉酶的总活力，从而推出β-淀粉酶的活力。

可行性分析：

温度可以通过恒温水浴来实现。试剂等都是实验室常见的，仪器实验室也有。

五、具体实验设计

1、所用相关试剂：

1%淀粉溶液，pH5.6的柠檬缓冲液，3,5-二硝基水杨酸，麦芽糖标准液，0.4M NaOH 2、相关仪器：

分光光度计，水浴锅，离心机

3、实验步骤：

（1）酶液的制备

称取2g萌发的小麦种子；研磨成匀浆；转移到50ml容量瓶中至40ml左右，室温浸提15-20min后定容；混匀后3500rpm/min，离心20min，取上清液备用

（3）α-淀粉酶及β-淀粉酶总活性的测定

（4）麦芽糖的测定

α-淀粉酶活性[(mg/g)/(g/min)]=[(A-A’)*样品稀释总体积]/[(样品重g)*5] (α-+β-)淀粉酶总活性[(mg/g)/(g/min)] =[(B-B’)*样品稀释总体积]/[(样品重g)*5]

A——α-淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度

A’——α-淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度

B——(α-+β-)淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度

B’——(α-+β-)淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度

六、质疑及相关思考

酶的活力主要体现在初速度上，应该如何控制反应时间，从而得出的结果为酶促反应的初速度。

高温条件下β-淀粉酶的活性是否被完全抑制，同时α-淀粉酶的活性是否没有改变。

七、思考题

1.酶活力测定实验的总体思路你认为应该是什么？

酶的活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数。

实验的总体思路是测定每分钟内催化生成的麦芽糖的量。而且酶促反应的初速度才是反应酶活的指标。

2.由上述总体思路你认为酶活力测定实验中最关键的设计应该是什么？为什么？在该项设计中要注意什么？

影响酶活力的因素很多，要测定酶的活力就需要创造合适的条件。材料中有两种淀粉酶，本实验的关键是如何抑制一种酶的活性，而另一种酶的活性没有太大改变。

在实验的过程中，水浴的时间一定要到位，如果干扰酶的活性没有被完全抑制，则会严重影响实验结果。

3.淀粉酶和转氨酶的作用各自有何特点？在设计其酶活力测定的具体实验方案时，你认为主要应该有哪些针对性的考虑？

淀粉酶和转氨酶属于不同类型的酶。淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶，转氨酶是催化α-酮酸和α-氨基酸之间转氨作用的酶，它们产物不同，最适条件不同。

保证在最适温度，pH等条件下测定其酶活力。

4．酶促反应的特点？规定酶活力单位的作用？酶活力单位想表征的内涵是什么？其规定有什么特点？

酶具有高效性和专一性，同时要求温和的反应条件。

规定酶活力单位可定量表示酶的催化效率。一个酶活力单位，是指在最适条件下（25︒C，最适pH，充足底物），每分钟内能催化1 μmol底物所需要的酶量。酶活力单位可以用于衡量酶的活性，从而在生产上起指导作用。

5. 所有酶活力测定方法中都有所谓的“对照管”的设计，为什么？其作用是什么？在对它的设计上有何特点？

最主要的作用是控制变量，对照管的设计是用于排除变量以外的其他变量对于体系的影响，尽可能的消除实验的误差。在测定α-淀粉酶的实验中，对照组先加NaOH的作用是使酶失活，从而结果中可以反映酶失活后没有产物生成，得出酶对于反应的进行十分重要。对照组除了要研究得变量意外其他的和实验组一样。

6. 以你们对相关知识的理解，试着分析一下禾谷类种子（如：小麦）萌发过程中的主要代谢特点及可能的代谢途径。

禾谷类种子萌发过程中，种子吸水，内部代谢增强。β-淀粉酶主要预存在胚乳中，α-淀粉酶的产生则与GA的诱导有关。盾片和胚芽鞘产生GA，转运到糊粉层，GA诱导糊粉层合成α-淀粉酶，α-淀粉酶合成后分泌到胚乳。胚乳水解产生的可溶性糖输送到胚的生长部位，作为营养利用。

7．众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均采取钝化β-淀粉酶的活力而测α-淀粉酶和测总酶活力的策略，为何不采取钝化α-淀粉酶活力去测β-淀粉酶活力呢？这种设计思路说明什麽？

温度变量更好控制，高温对于α-淀粉酶的活力没有多大影响，而对于β-淀粉酶则有很好的抑制作用。强酸或强碱的条件下也能催化淀粉的水解，同时在体系中引入了其他的离子，这对于实验的准确性是不利的。

8．有人认为本实验中可以用对照管调分光光度计的100%T 从而获知测定管的OD 值，你的观点呢？为什麽？你认为本实验中设计的对照管与比色法测定物质含量实验中设计的空白管有何异同？

不可以，因为空白管是用于得出标准曲线中的麦芽糖含量，而对照管中可能含有少量的麦芽糖所以不能用对照管作为0基准。

空白管的作用是用来调节0点和透光率100%的，而对照管的目的是为了排除因为在种子萌发的过程中造成的少量的麦芽糖生成的影响。但两者从原理上都是为了消除部分影响因素对于光吸收的干扰。