实验13地衣酚法测定rna含量-华南师范大学生命科学学院新
实验三_酵母RNA的提取及含量测定
酵母RNA的提取及含量测定一、实验目的与要求1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法；2、了解测量核酸浓度不同方法的原理；3、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法；4、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。
二、实验原理1、RNA提取原理：由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。
一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。
其中苯酚法又是实验是最常用的。
组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。
向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。
上述方法提取的RNA具有生物活性。
工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。
浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。
稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。
酵母含RNA 达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。
2、测定RNA含量的方法：（1）紫外吸收法原理：核酸具有吸收紫外线的性质，在波长260纳米处有最大吸收，且在一定浓度范围内光吸收值与浓度成正比（0—50微克/毫升），符合朗伯-比尔定律。
优点样品用量少，不用显色，测完后样品可以继续使用。
（2）地衣酚显色法：核酸与浓盐酸共热，放生降解，生成糠醛，后者与地衣酚反应，在三价铁离子或二价铜离子作用下，生成鲜绿色的复合物，670纳米处有最大吸收，且光吸收值与浓度成正比，符合朗伯-比尔定律。
缺点反应特异性差，易受干扰。
（3）定磷法：在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中无机磷酸生成磷钼酸，当有还原剂存在时，磷钼酸立即被还原生成蓝色的还原产物--钼蓝，其最大吸收在660纳米处，当无机磷含量在每毫升1-25微克范围内，光吸收与含磷量成正比。
分析化学实验报告6. RNA提取-2013-10
实验七. 酵母RNA提取与地衣酚测定法[目的和要求]1.了解并掌握稀碱法制备酵母RNA的原理及方法。
2. 掌握地衣酚法测定RNA含量的原理及方法。
[实验原理]稀碱法原理: 酵母RNA可溶于碱性溶液。
经稀碱液处理的酵母，细胞壁变性，释放出RNA，当溶液中的碱被中和后，加入的乙醇可使RNA沉淀，由此得RNA的粗制品。
地衣酚法原理: 核糖核酸与浓盐酸共热时发生降解，形成的核糖转变成糖醛，后者与地衣酚(3，5—二羟基甲苯)缩合成为绿色化合物，反应以铜离子作为催化剂，产物在670nm处有最大吸光度。
RNA在20～250μg／mL范围内，光密度与RNA 的浓度成正比。
地衣酚反应的特异性较差，凡戊糖均有此反应。
[实验器材]稀碱法使用器材:研钵(X1)，锥形瓶(100 mLXl)，电炉，抽滤装置(X1)，滴管(X1)，玻璃棒(X1)，量筒(50 mLXl)，烧杯(100 mLXl，50 mLXl)，离心机，离心管。
地衣酚法使用器材:恒温水浴，吸量管(1 mL，2 mL，5 mL)，试管及试管架，S54/53型分光光度计。
[实验材料及试剂]稀碱法使用试剂:(1) 0.2% NaOH溶液100 mL，酵母片，95％乙醇。
(2) 酸性乙醇溶液地衣酚法使用试剂:(1)RNA标准液：为100μg／mL的标准溶液。
(2)地衣酚-铜离子试剂(3)样品溶液：RNA质量浓度为200μg／mL。
[实验步骤]稀碱法实验步骤:取20片酵母于研钵内，加入20 mL 0.2% NaOH，研磨成浆状。
再加入20 mL 0.2% NaOH将其转移至100 mL锥形瓶中，沸水浴上加热30 min，搅拌，冷却，3 000 rp／min, 离心15 min。
将上清液缓缓倾入40mL酸性95％乙醇溶液中(注意要一边搅拌一边缓缓倾入)。
待RNA沉淀完全后，4 000 r／min离心15 min，弃去上清液。
留沉淀，加95％乙醇5 —10 mL，充分搅拌，然后在布氏漏斗上用水泵进行抽滤，再用95％乙醇约20mL分3次淋洗(快速，稍干即收)。
酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定
整理课件
1
【实验目的】
1.学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法。 2.了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的
方法。 3.掌握地衣酚显色法及紫外分光光度法测定
酵母RNA含量的原理和方法
【实验原理】
酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，
Hale Waihona Puke 在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核
1.实验材料：
酵母粉 (或酵母片)
2.实验仪器：
研钵、150mL锥形瓶、恒温水浴锅、布氏漏斗 及抽滤瓶、离心机、漏斗、分光光度计。
整理课件
5
【实验材料和主要仪器、试剂】
3.实验试剂： 0.04mol/LNaOH溶液、95%乙醇、酸性乙醇 溶液、1.5mol/L硫酸溶液 、浓氨水、 0.1mol/L硝酸银溶液 、氯化铁浓盐酸溶 液、苔黑酚乙醇溶液、钼酸铵试剂（将2g 钼酸铵溶解在100ml10%硫酸中）、标准 RNA母液、标准RNA溶液、样品溶液、地衣 酚-铜离子试剂
本法特异性较差,凡属戊糖均有反应.微量DNA 无影响,较多DNA存在时,亦有干扰作用。如在 试剂中加入适量CuCl2 .2H2O可减少DNA的干 扰。此外,利用RNA和DNA显色复合物的最大 光吸收不同,且在不同时间显示最大色度加以区 分。反应2min后,DNA在600nm呈现最大光 吸收,而RNA则在反应整理1课5件min后,在670nm下1呈3
脱氧核糖，为什么？ 3、用你所学过的化学知识,分析3种催化剂： FeC13·6H2O,CuC12·H2O和CuO,哪种催化
剂的催化效果更好？ 4、地衣酚反应中,干扰RNA测定的因素有哪
些 如何能减少它们的影响。
整理课件
核酸的实验
实验操作
(一) DNP与RNP的分离 DNP与RNP的分离 1、 取新鲜肝脏，用表面皿称取0.5g，用0.14mol/L氯化钠 取新鲜肝脏，用表面皿称取0.5g， 0.14mol/L氯化钠 -0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液（含1mmol/L EDTA）冲洗除去血 0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液 柠檬酸钠缓冲液（ EDTA） 水。洗净后立即将肝脏置于冰浴研钵中，边滴加缓冲液边研磨 洗净后立即将肝脏置于冰浴研钵中， (加入 加入2ml），至匀浆状，转移至离心管中，每次用0.5ml缓冲 ），至匀浆状 ），至匀浆状，转移至离心管中，每次用0.5ml缓冲 液冲洗研钵至离心管， 研磨时间不要超过30min） 液冲洗研钵至离心管，3次。（研磨时间不要超过30min） 2、 匀浆液于3000r/min 离心15min，上清液中即含RNP 匀浆液于3000r/min 离心15min，上清液中即含RNP ，沉淀中含DNP。 沉淀中含DNP。 3、将上清液倒入另一支离心管。再往上述沉淀中加入 将上清液倒入另一支离心管。 3.5ml缓冲溶液 同样离心15min， 3.5ml缓冲溶液，同样离心15min，取上清液倒入另一离心管 缓冲溶液， 。向DNP沉淀加入3ml 10%氯化钠溶液，摇匀，置于冰箱内， DNP沉淀加入 沉淀加入3ml 10%氯化钠溶液，摇匀，置于冰箱内， 氯化钠溶液 DNP充分溶解 留至下午用。 充分溶解， 使DNP充分溶解，留至下午用。
实验3 实验3
二苯胺法测量DNA 二苯胺法测量DNA含量 DNA含量
实验目的
学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。 学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。 含量的原理和方法
实验原理
DNA分子中的 DNA分子中的2—脱氧核糖在酸性条件中脱水生成ω分子中的2 脱氧核糖在酸性条件中脱水生成ω 羟基- 酮基戊醛， 羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂一起加热反应生成 蓝色物质， 595nm处有最大吸收 DNA在40~400µg范 处有最大吸收。 蓝色物质，在595nm处有最大吸收。DNA在40~400µg范 围内，光密度与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少 围内，光密度与DNA的浓度成正比。 的浓度成正比 量乙醛，可以提高反应灵敏度。 量乙醛，可以提高反应灵敏度。
生物化学 自测题 无答案。
自测题一一、填空（每空1分，共40分）：1．Pauling等人提出的蛋白质二级结构螺旋模型，每圈螺旋包含个氨基酸，每个螺旋的垂直高度为。
2．DEAE-纤维素是一种交换剂，CM-纤维素是一种交换剂。
3．电子传递链中与蛋白质结合不紧的传递体是，专门传递电子而不传递氢的传递体系是。
4．TCA循环中，三羧酸物质有和。
5．在鸟氨酸循环中，精氨酸是生成和的前体。
6．DNA变性后粘度，A260值；影响DNA Tm值的因素有、和。
7．氨基酸合成代谢中通过直接转氨生成的氨基酸有、、、和。
8．乳糖操纵子的阻遏蛋白是由基因编码，与基因结合阻止转录。
9．可转变为丙酮酸的氨基酸有种，脯氨酸是由产生的。
10．带负电荷的蛋白质与阴离子交换树脂结合很紧，必须用pH或用离子强度洗脱液才能把该蛋白质洗下来。
11．单糖在酸作用下脱水生成，用地衣酚法测定RNA含量是根据反应，二苯胺法测定DNA含量是根据反应。
12．二十种氨基酸中无不对称碳原子，与茚三酮反应生成黄色物质，可以参与形成二硫键。
13．在乳酸发酵过程中，若用14C标记葡萄糖的第三位和第四位碳原子，生成的乳酸分子中碳原子带有标记。
14．一个乙酰CoA通过TCA循环生成ATP。
一个C16脂肪酸彻底氧化分解净生成ATP。
15．脂肪酸合成的限速反应是，催化这个反应的酶是。
16．在糖酵解途径中，葡萄糖经化和化，生成F-1,6-P，然后裂解为。
二、选择题（10分）：1．测定酶活性时测定酶促反应的初速度，其目的是：A．为了提高测定的灵敏度B．为了防止出现底物抑制C．为了节约使用底物D．使酶促反应速度与酶浓度成正比2．关于别构调节酶正确的叙述是：A．所有别构酶都有一个调节亚基，一个催化亚基B．别构酶的动力学特点，是酶促反应与底物浓度的关系呈S形而不是双曲线形C．效应物对别构酶的作用和离子、激活剂对酶激活的机制相同D．别构抑制与竞争性抑制相同3．溶菌酶活性部位是由下列哪两种氨基酸组成：A．谷氨酸和天冬氨酸B．谷氨酸和赖氨酸C．天冬氨酸和精氨酸D．天冬氨酸和赖氨酸4．假尿嘧啶核苷的糖苷键是：A．C-C连接B．C-N连接C．N-N连接D．C-H连接5．脂肪酸合成A．不需乙酰CoA B．丙二酰CoA参加脂肪酸合成的起始和延伸C．有线粒体内进行D．最终产物为十碳以下脂酸6．能转变为乙酰乙酰CoA的氨基酸为：A．精氨酸B．苏氨酸C．亮氨酸D．甲硫氨酸7．下列试剂最适于测定短肽氨基酸顺序的是：A．茚三酮B．溴化氢C．胰蛋白酶D．异硫氰酸苯酯8．血红蛋白和肌红蛋白都是氧的载体蛋白，两者在体内具有不同的功能，前者运输氧和二氧化碳；后者只能贮存氧，供肌肉线粒体利用，这是因为：A．两者的蛋白质结构不相同B．血红蛋白可以与DPG结合，肌红蛋白则不能C．血红蛋白与氧的亲和力与环境中的氧分压有关D．肌红蛋白与氧的亲和力太低9．下列关于细菌蛋白质生物合成的叙述，错误的是：A．起始复合物形成的过程中，需要GTP参加B．移位反应需要GTPC．移位反应不需要GTPD．肽链延长的过程中，需要EF-Ts10．生物体内能直接催化将游离NH3与氨基酸分子结合的酶是：A．丙氨酸转氨酶B．谷氨酰胺合成酶C．谷氨酸脱氢酶D．天冬氨酸转氨酶三、判断题（10分）：1．米氏常数是酶与底物形成复合物的结合常数。
实验十六、RNA的定量测定
三、试剂和器材
1. 试剂 0.1mg/mL标准RNA溶液、地衣酚试剂、 2. 器材 可见分光光度计、恒温水浴锅
四、操作步骤
1. 标准曲线的绘制 取12只试管分成6组，按下表操作。取2管的平均值， 以DNA浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。
试管
标准RNA/mL 标准 蒸馏水/mL 蒸馏水 地衣酚试剂/mL 地衣酚试剂
待测样品中测得的RNA的µg数 的 数 待测样品中测得的
X 100
RNA%＝ RNA% 样品蛋白质含量高时，应先用5％TCA沉淀蛋 白质；有较多DNA样品时也会发生干扰，可在试 剂中加适量的CuCl2. H2O， 可减少DNA的干扰。 六、思考题
实验十六 RNA的定量测定 的定量测定
一、实验目的
掌握用地衣酚法测定RNA含量的原理和方法。
二、原理
当RNA与地衣酚试剂在沸水中加热时，RNA 被酸降解，所产生的核糖进一步转变为糠醛，它 与地衣酚(3，5-二羟基甲苯)在高铁离子的催化下 可反应生成绿色物，后者在670nm处有最大吸收 峰，在10～100µg/mL范围内其光密度值与RNA 浓度有线形关系。
0 0 2 2
1 0.4 1.6 2
2 0.8 1.2 2
3 1.2 0.8 2
4 1.6 0.4 2
5 2.0 0 2
混合均匀后，置沸水浴中加热45min，冷却， 670nm波长处比色 混合均匀后，置沸水浴中加热45min，冷却，在670nm波长处比色 浴中加热45min 光密度值
2. 样品的测定 取待测样品1mL，加蒸馏水1mL及二苯胺溶 液2mL，沸水浴保温45min，冷却，然后在670nm 波长出测定光密度值。根据测得的光密度值，从 标准曲线上查得相应的RNA的µg数，按下式计算待 测样品的RNA的含量。
RNA的分离提取和测定
指导教师：赵建军
实验目的
学习从兔肝中提取RNA的方法。
通过地衣酚显色法测定R置于醋酸钠缓冲液，SDS，80%酚溶液中的细胞经高速 匀浆后再离心，上层含有水溶性RNA，多糖和小分子 极性物质以及残留的变性蛋白质。下层含有变性蛋白 质和DNA。两相之间有一层凝集的变性蛋白质。水相用 乙醇沉淀，离心后可得RNA 制品。 RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而 转变成糠醛，后者与3， 5-二羟甲苯反应呈鲜绿色，反 应产物在680nm处有最大吸收，光吸收与RNA浓度 成 正比。
实验试剂
1、RNA标准溶液： 取标准RNA配成100μ g/ml溶液。 2、样品待测液： 准 确 稀 释 成 每 毫 升 溶 液 含 RNA 干 燥 制 品 50100μ g。 3、地衣酚试剂： 先配制0.1%三氯化铁的浓盐酸溶液，实验前以 此溶液为溶剂配成0.1%地衣酚溶液。
提取过程
NaAc（0.05mol/L） 10min 兔肝（0.9g） 浸泡 pH5.0 SDS（250g/L） 80%酚 匀浆 1.5ml 等体积 量取水相 NaAc（2mol/L） 混匀 1/10体积 3000r/min 10min 沉淀 65℃ 匀浆 5-8min NaAc（0.05mol/L） 吸干水分 pH5.0，9.0ml 3000r/min 10-15min
冷却
离心
预冷95%乙醇 混匀 冰浴 沉淀生成 2.5倍 蒸馏水 5ml 溶解备用
离心
测定过程
管号 试剂 ml RNA 标准液 蒸馏水 地衣酚试剂
0 0 2.0 2.0
1 0.4 1.6 2.0
2 0.8 1.2 2.0
3 1.2 0.8 2.0
4 1.6 0.4 2.0
生化实验 地衣酚法测定肝组织中RNA含量
地衣酚法测定肝组织中RNA含量
【实验目的】
掌握用地衣酚法测定RNA含量的原理和方法。
【实验原理】
核酸在碱性条件下水解为碱基、五碳糖和磷酸，这三个组分在核酸分子中等比例存在，故测定其中任一组分均可计算出核酸的量。
酸性条件下RNA中的核糖脱水环化成糠醛，地衣酚(3，5二羟基甲苯)可与其作用呈绿色，在670nm处有最大吸收。
当待测样品中RNA含量在5~50μg/ml范围内时，O.D值与RNA浓度成正比。
用分光光度计测得反应液O.D值，即光密度（特定波长下的吸光度）从而可知样品中RNA的含量。
反应式如下：
【仪器与试剂】
仪器：
721分光光度计、恒温水浴箱
试剂：
）溶液、6mol/L HCl、地衣酚试剂、RNA标准液（0.1mg/ml）5%高氯酸（HClO
4
【实验步骤】
1.待测样品的稀释
取实验一分离所得RNA的上清液1ml，加入5%HClO
5ml,摇匀（此液稀释了5倍）。
4
混匀各管，沸水浴10min（注意严格控制时间）。
3.待上述各管冷却后，以空白管调零点，670nm比色，读取光密度（O.D）。
重复测量3-5组数据，取平均值。
4.计算每克肝组织中RNA含量，单位为毫克每克组织。
【思考题】
1.为何要将分离后的RNA上清液稀释5倍？
2.如何根据数据计算出DNA的含量，请写出公式，解释意义并将其含量计算出来。
分子生物学实验报告
根据测得的O.D值，从标准曲线上查出相对应的RNA含量，按下式计算出制品中RNA的百分含量：
×100%
（4）醋酸纤维素薄膜电泳法分离测定RNA的四种碱基
1）RNA的碱水解：
称取0.20gRNA，溶于5ml 0.3mol/L KOH溶液中，使RNA的浓度达到20～30mg/ml。沸水浴加热30min。将水解液转入到锥形瓶中。冰浴，在冰浴过程中用高锰酸溶液滴定到水解液的PH值为3.5.在2500rpm离心10min。出去沉淀，上层液即是样品。
2）RNA基团鉴定和地衣酚法测定RNA含量的基本原理：
RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸组分，加硫酸煮沸可使其水解，用硝酸银、地衣酚和定磷试剂可分别鉴定嘌呤碱、核糖和磷酸组分。
A：嘌呤鉴定：
嘌呤碱与硝酸银反应可生成白色的嘌呤银化物沉淀。
H2SO4AgNo3
RNA嘌呤嘌呤银化物（白色或红棕色）
100℃
酵母含RNA 达2.67—10.0%，DNA 则少于0.03—0.516％。为此，提取RNA多以酵母为原料。
由于RNA得来源很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、稀碱法和浓盐法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的方法，次方法能够较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性，两种常见的方法原理为：
核糖定量反应：
RNA
HCl
93℃
4）使用电泳技术进行RNA鉴定的基本原理：
任何物质质点，由于其本身在溶液中的解离或是由于其表面对其他带电质点的吸附，会在电场中向一定的电极移动。一般来说，在碱性溶液中，分子带负电荷，在电场中向正极移动；而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动。不同质点在电场中的移动速度不同，常用泳动度（迁移率）来表示。即带电质点在单位电场强度下的泳动速度。电泳快慢与电场强度、溶液的PH值、溶液的离子强度、电渗现象有关。
RNA的制备及含量测定
1、初步掌握752型分光光度计的使用。 2、掌握地衣酚法测定细胞RNA的含量。
实验原理
小鼠肝细胞中RNA含量丰富，核酸溶于水而 不溶于有机溶剂，可用水与酚的混合液将核酸与其 它有机杂质分离。同时在4℃低温下加入SDS抑制核 酸酶活性，保护核酸的结构不被破坏。在0.14mol/L NaCl溶液中RNP溶解度高而DNP溶解度低，从而将 二者分开。在强酸溶液中RNA水解产生的戊糖生成 糠醛，用分光光度计在670nm波长下测定其OD值， 与RNA标准曲线比较得到RNA的含量。
实验步骤
2. RNA的含量测定 (1)样液的制备：将提取的RNA中加入2mRNA浓度为横坐标，光吸收 值为纵坐标，绘出标准曲线。
实验步骤
管号 100μg/ml RNA 标准液(ml) 蒸馏水(ml) 样品液（ml） 地衣酚试剂（ml） RNA 浓度(μg/ml) OD 值（670nm） 0 10 1 0 2.5 － 2 0.5 2 － 3 1 1.5 － 20 4 1.5 1 － 30 5 2 0.5 － 40 6 2.5 0 － 50 7 － 2.4 0.1 － 8 － 2.4 0.1 －
各加入 2.5ml 混匀，沸水浴 20min
实验结果
样品RNA含量的测定： 计算1g小鼠肝脏中RNA的量
实验步骤
1.RNA的提取：用断颈法处死小白鼠，取出肝脏，用滤纸吸去 血液，称取0.5g鼠肝＋少量石英砂＋1ml SDS缓冲液分2－ 3次洗涤研钵后一并倒入离心管中加入等体积含水酚室温下 剧烈震荡10分钟，平衡后3000转/分离心15分钟，取上清 液加入等体积氯仿－异戊醇，室温下剧烈震荡10分钟，平 衡后3000转/分离心10分钟，取上清液加入2倍体积2﹪乙 酸钾的乙醇溶液，冰浴中放置1小时使RNA沉淀析出，平衡、 以3000转/分离心10分钟，弃去上清液，沉淀中加入约5ml 95﹪乙醇洗涤沉淀，平衡后以3000转/分离心5分钟，弃去 上清液，沉淀即为提取的RNA。
酵母RNA的提取与地衣酚显色测定法组
实验目的：
1、掌握RNA提取的原理和方法； 2、掌握地衣酚显色法测定RNA含量
的原理和方法。
实验原理：
酵母中RNA含量较多, 含量可达2.67～10.0%， DNA很少（0.03～0.516％），是提取RNA的理想 材料。 RNA可溶于碱性溶液，细胞裂解后离心去除 沉淀（细胞碎片），当碱被中和后，上清液中加 入乙醇可以使核糖核酸沉淀，离心弃上清液，可 得到RNA的粗制品。
2、地衣酚(浓HCl配制，注意安全）显色测定RNA
1、标准曲线的绘制
0 RNA标准液ml 0
蒸馏水ml 2.0 地衣酚试剂ml 2.0
1 0.4
1.6 2.0
2 0.8
4 1.6
0.4 2.0
5 2.0
0 2.0
混匀，沸水浴25min，冷却，测各管A670nm，以A670nm 为纵坐标，RNA量（ug）为横坐标作图。
实验材料。
地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。因
此地衣酚实验不能作为RNA与DNA鉴别的依据。
思考题：
现有三瓶未知溶液，已知它们分别为蛋 白质、糖和RNA，采用什么试剂和方法 鉴定？
地衣酚显色法：核糖核酸与浓盐酸共热时，即发 生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与地衣酚 （3，5-二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯 化铁或氯化铜作催化剂。 （1）RNA HCl 核糖 糠醛
Fe3+或Cu2+
（2）糠醛+地衣酚
鲜绿色复合物（ 670nm ）
实验操作：
1、提取核糖核酸 4.0g干酵母+40ml 0.2%氢氧化钠（100ml烧 杯内操作），沸水浴30min并不断搅拌；冷却后 加入数滴冰乙酸使PH值约为5.5左右，4000r/min 离心10min，取上清液加30ml 95%乙醇溶液，注 意要一边搅拌一边缓缓倾入；静置5min以上待 RNA沉淀完全后 4000r/min离心10min，弃上清， RNA沉淀用95%乙醇（每次约10ml）洗涤两次； 取出沉淀，在滤纸上晾干（可先晾干一部分进行 定量测定）并称重。
地衣酚法实验报告
1. 掌握地衣酚法测定RNA含量的原理和方法。
2. 学习实验操作技能，提高实验操作的准确性。
3. 了解RNA在生物体中的重要作用。
二、实验原理地衣酚法是一种常用的RNA定量方法。
其原理是：RNA与浓盐酸共热，降解形成的核糖转变为糠醛，糠醛与地衣酚反应生成紫色化合物。
通过比色法测定紫色化合物的吸光度，即可计算出RNA的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细菌RNA提取液- 标准RNA溶液- 浓盐酸- 地衣酚- 氢氧化钠- 无水乙醇- 水浴锅- 离心机- 移液器- 比色计2. 实验试剂：- 地衣酚试剂：将地衣酚0.5g溶于100mL 95%乙醇中。
- 氢氧化钠溶液：称取10g氢氧化钠，加入少量蒸馏水溶解，转移至100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度。
1. 准备工作- 将细菌RNA提取液和标准RNA溶液分别用移液器移取适量至试管中，加入等体积的浓盐酸，混匀后置于水浴锅中加热10分钟。
- 加热结束后，加入等体积的无水乙醇，混匀后静置10分钟，离心取沉淀。
- 将沉淀用少量蒸馏水洗涤两次，离心取沉淀。
- 将沉淀溶于少量蒸馏水中，加入等体积的氢氧化钠溶液，混匀。
2. 比色- 将上述溶液加入地衣酚试剂，混匀后置于室温下反应30分钟。
- 使用比色计在540nm波长下测定吸光度。
3. 数据处理- 以标准RNA溶液的吸光度为纵坐标，RNA浓度为横坐标，绘制标准曲线。
- 根据实验样品的吸光度，从标准曲线上查得对应的RNA浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制- 标准曲线线性良好，相关系数R²=0.99。
2. 实验样品RNA含量测定- 实验样品的吸光度为0.65，从标准曲线上查得RNA浓度为100ng/μL。
六、实验讨论1. 实验过程中，RNA降解可能受到多种因素的影响，如温度、时间、酸碱度等。
因此，在实验过程中应严格控制实验条件，以保证实验结果的准确性。
2. 地衣酚法测定RNA含量具有较高的灵敏度，但特异性较差，戊糖等物质也会产生类似的紫色化合物。
酵母RNA的提取与测定
实验项目名称酵母RNA的提取与测定一、实验目的1.了解并掌握稀碱法提取 RNA。
2.学习地衣酚显色法测定RNA含量的基本原理和具体方法。
二、实验原理1. 细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。
因此，分离制备RNA时，首先遇到的是必须使RNA与蛋白解离，并除去蛋白质。
2. 由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异。
一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。
其中苯酚法又是实验室最常用的。
组织匀桨用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加人乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。
上述方法提取的RNA具有生物活性。
工业上常用碱法和浓盐法提取RNA，用这2种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核酸的原料，其工艺比较简单。
浓盐法是用有10%左右氯化纳溶液，90℃提取3~4 h , 迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀 RNA。
稀碱法使用稀碱（本实验用0.2% NaOH 溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀 RNA 或调pH 2.5 利用等电点沉淀。
酵母含 RNA 达2.67~10.0%，而 DNA 含量仅为0.03 - 0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。
DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260 nm波长处。
紫外吸收是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质，所有含嘌呤和嘧啶的物质，都具有吸收紫外线的特性。
因此，RNA含量测定，可用紫外吸收法。
紫外吸收法具有操作简便、快速、灵敏度高、对被测样品无损、用量少等优点，适合于核酸分离纯化过程的检测。
该法对纯品核酸准确度高，但由于有紫外吸收的物质对测定有干扰，对不纯核酸样品误差较大。
若样品内混杂大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外线的物质，应设法事先除去。
3.细胞破碎方法-机械物理法：可以用研磨和组织捣碎法。
实验13地衣酚法测定rna含量-华南师范大学生命科学学院新
一、目的学习和掌握测定RNA含量的定糖法（地衣酚法）的原理和操作技术。
二、原理核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糖醛，后者与3，5—二羟基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收，RNA浓度在20~200微克/毫升范围内，光密度与RNA的浓度成正比关系，在反应液中如混有DNA或其他杂质。
也能给出类似的颜色。
因此测定RNA时可先测定DNA的含量，再计算RNA的含量。
地衣酚法只能测定RNA中与嘌呤连接的核糖，不同来源的RNA所含嘌呤与嘧啶的比例各不相同，因此，用所测得的核糖量来换算各种RNA的含量存在误差。
最好用被测样品相同来源的纯化RNA作RNA-核糖标准曲线，然后从曲线求得被测样品的RNA含量。
三、材料、试剂和器具（一）试剂1、RNA标准溶液：取酵母RNA配成200微克/毫升的标准溶液（如不溶，可滴加氢氧化铵溶液，调至pH=）2、样品溶液：RNA浓度在20~100微克/毫升范围内。
（自己提取）3、地衣酚试剂，先配制%三氯化铁浓盐酸溶液（A、R）。
使用前再用上述溶液为溶剂配成%的地衣酚溶液。
（临用时配制）（二）器具1、试管及管架2、水浴锅3、移液管（1，2，5ml）4、可见光分光光度计四、操作步骤（一）RNA标准曲线的制作取8支试管，编号，按下表加入试剂加毕，摇匀，置沸水浴中加热15分钟，冷却，测值。
以值为纵坐标，RNA含量（微克/毫升）为横坐标作图绘制标准曲线。
（二）样品的测定取~毫升样品液于试管中，加蒸馏水稀释至2毫升，后加2毫升地衣酚试剂摇匀，于沸水中煮15分钟，冷却，测。
根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度的RNA 的含量，按下式计算样品中RNA的百分含量。
RNA含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数RNA产率（%）=含量/毫升×总体积×100新鲜肝重（g）×106五、注意事项样品中蛋白质含量较高时，应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定。
生物化学实验报告参考地衣酚法测定RNA含量
生物化学实验报告参考实验13 地衣酚法测定RNA 含量一、实验目的学习和掌握定糖法（地衣酚法）测定RNA 含量的原理和操作技术。
二、实验原理CHOC H C H C H CH 2OHOHOH OH浓HCl-3H 2O O CHO OH O H CH3Fe 3+,O C O CH 3OH O H反应产物在670nm 处有最大吸收，RNA 浓度在20~200μg/ mL 范围内，光密度与RNA 的浓度成正比关系，因而可用分光光度法测定RNA 含量。
三、材料、试剂和器具（一）试剂1、RNA 标准液；2、样品溶液（未知和提取的）；3、地衣酚试剂（二）器具比色管、水浴锅、移液管、721分光光度计等四、操作步骤 （按下表进行） 1、RNA 标准曲线的制作； 2、样品的测定序号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 RNA标准液/mL0 0.2 0.4 0.8 1.0 1.2 1.6 2.0 未知样/mL0.5 0.1 蒸馏水/mL2.0 1.8 1.6 1.2 1.0 0.8 0.4 0 1.5 1.9 地衣酚试剂/mL2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 摇匀，沸水浴加热20min ，冷却，各管补加蒸馏水2.0mL ，测其OD 670nm 值 RNA 含量 (μg/mL)0 6.7 13.3 26.7 33.3 40.0 53.3 66.7 OD 670nm 0 0.052 0.118 0.190 0.30 0.375 0.467 0.54 0.165 0.326 注：RNA 标准液浓度为200μg/ mL五、数据记录与数据处理1、数据记录见上表2、数据处理以上表中的OD 670nm 纵坐标，RNA 含量(μg/mL)为横坐标作图绘制标准曲线，结果见下图。
由标准曲线查得相当该光密度的未知样和提取的RNA 含量分别为18.93μg/mL 、37.87μg/mL.(或把OD 670nm =0.165、0.326分别代入回归方程:y=0.0085x+0.0041得x 1=18.93、x 2=37.87).R A N 标准曲线图y = 0.0085x + 0R 2 = 0.9900.10.20.30.40.50.601020304050607080R N A 含量(u g /mO D 670n 由公式：待测液RNA μg/mL=标准曲线查得x 稀释倍数，得未知样RNA 含量=18.93 x （6÷0.5）=227.16μg/mL ；提取液RNA 含量=37.87 x （ 6 ÷0.1 ）=2272.2μg/mL 。
实验五RNA的定量测定
5、本方法的干扰物及其去除方法
(1)戊糖或含戊糖的物质对本法有干扰；某些己糖 也对本法有干扰（糖经浓无机酸脱水产生糠醛或糠醛衍 生物，在浓无机酸作用下，与苯酚生成缩合物）；去除 方法为，低浓度乙醇沉淀法和醋酸钾沉淀法，提高缓冲 液中NaCl浓度也可；在高浓度钠钾盐中，通过苯酚-氯 仿抽提可去除一些多糖（实际是去除糖蛋白）；用LiCl 沉淀RNA，可将部分多糖留在上清液中。 (2)因不同时期酵母RNA含量有所变化，若样品光密 度值均不在标准曲线范围，可减少加样品液量或增加 RNA粗品溶液的浓度。
（5）苔黑酚-三氯化铁试剂需临用时配制，由于试 剂中有浓盐酸，反应时 需加盖保险膜，防止盐酸挥发。
6、原始数据
管号
A670nm
0
1
2
3
4
5
样液 （上次实验 保存样品）
7、数据处理
• 7.1、标准曲线 • 7.2、样液的浓度 • 7.3、
样 0.1
浓度（ug/mL） A670nm
试剂加完后，摇匀，置沸水浴中煮45min。冷却后， 在670 nm波长处测各管光密度值。以A670为横坐标， 每管标准液浓度为纵坐标，绘制标准曲线。 4.2．样品中RNA的测定 取1支试管，加入2.Oml样品液，再加2.0ml苔黑酚 试剂，按标准曲线制作方法，测得吸光度值后，折算 成浓度。 注：样品液即上次实验提取的酵母RNA。
4、实验操作
4.1．标准曲线的制作
取6支试管，按下表1编号加入试剂。
表l.制作RNA标准曲线时各试剂用量
RNA标准液(m1) 蒸馏水(m1) 苔黑酚试剂(m1)
0 1 2 3 4 5 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 0 20 40 60 80 100
地衣酚法鉴定rna原理
地衣酚法鉴定rna原理
地衣酚法鉴定RNA的原理是利用地衣酚与RNA分子中的核糖-磷酸骨架相互作用，生成具有蓝色荧光的复合物。
在一定浓度范围内，荧光强度与RNA浓度成正比，因此可以用来定量测定RNA的浓度。
该方法具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，被广泛应用于RNA 的检测和定量分析。
需要注意的是，地衣酚法只能检测具有完整核糖-磷酸骨架结构的RNA，对于部分被修饰或破坏的RNA可能无法准确检测。
地衣酚法鉴定RNA的原理是利用地衣酚与RNA分子中的核糖-磷酸骨架相互作用，生成具有蓝色荧光的复合物。
在一定浓度范围内，荧光强度与RNA浓度成正比，因此可以用来定量测定RNA的浓度。
该方法具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，被广泛应用于RNA 的检测和定量分析。
地衣酚法的具体操作步骤包括将待测RNA溶液与地衣酚混合，然后在沸水浴中加热，使地衣酚与RNA分子发生反应。
反应完成后，将溶液冷却至室温，加入荧光素，形成具有荧光的复合物。
最后，通过荧光强度测量仪测定荧光强度，并根据标准曲线计算RNA的浓度。
需要注意的是，地衣酚法只能检测具有完整核糖-磷酸骨架结构的RNA，对于部分被修饰或破坏的RNA可能无法准确检测。
此外，地衣酚法还存在一些局限性，例如对于低浓度的RNA可能不敏感，对于不同种类的RNA可能存在差异等。
因此，在使用地衣酚法进行RNA检测和定量分析时，需要结合其他方法进行综合分析。
实验二 紫外光吸收法测RNA的含量
实验二紫外光吸收法测RNA的含量生命科学学院生科四班张行润200900140177一、实验目的1.了解紫外吸收法测定RNA含量的原理2.熟悉紫外分光光度计的使用二、实验原理RNA在260nm处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可以用紫外分光光度计通过比色来测定RNA含量。
由于蛋白质在280nm波长处也有光吸收，对RNA测定有一定的干扰作用，但蛋白质的最大吸收峰在280nm处，如同时测定280nm的光吸收，通过计算可消除其对RNA测定的影响。
因此如其中含有蛋白质时必须同时测定280nm和260nm的吸光度，可通过计算测定溶液中RNA的含量。
三、实验器材1．材料：第一次实验所提取的酵母RNA，标准RNA液（100ug/ml），0.2%NaoH溶液，蒸馏水2．主要仪器（1）分析天平（2）紫外分光光度计（3）烧杯（100mL）（4）容量瓶（100mL）（5）移液管（0.5ml、2mL 和5mL）（6）药品勺和玻璃棒（7）试管和试管架（8）试管9支四、实验步骤1.样品处理称取0.2—0.25g粗品RNA，加入2ml 0.2%氢氧化钠溶液和1ml 蒸馏水溶解，调成糊状，再加入40ml-50ml蒸馏水溶解，调PH至7.0，待液体透明清澈后定容至100ml（再取2ml定容至100ml）待测注：本次实验中我们所取粗酵母RNA样品为0.1268g（由于实验材料不够）2.设计一系列浓度梯度的标准RNA溶液（5-45ug/ml），然后测得其各个浓度的Abs值，求其直线关系（标准RNA 100ug/ml），实验设计如下：五、注意事项1.在由标准RNA溶液所配置的系列梯度溶液必须含有0这个浓度，用于参比校准；2.用紫外分光光度计测定Abs值时应首先用系列溶液中的0浓度进行校准；3.紫外分光光度计所使用的比色皿必须保证其光面洁净，若有液体可用吸水纸吸干，不可以擦，其他可用擦镜纸擦干净，以免影响实验结果六、实验结果1.2.由紫外分光光度计所测得的待测液结果取平均后得其Abs值为0.450，以系列浓度梯度的标准RNA溶液与吸光度作图成直线关系图一：酵母RNA OD值——标准RNA溶液浓度工作线（λ=260nm）✧作图得待测液（稀释后）的浓度为20.03ug/ml✧酵母RNA的含量m=20.03×100×50=100150 ug=0.10015g✧称取的粗酵母RNA的质量M=0.1268g✧所得酵母RNA的纯度w=m/M×100%=0.10015/0.1268×100%=79.0%七、分析讨论及误差分析本次实验所测的的酵母RNA纯度为79.0%，经过查阅资料和与其他小组相比较，这一纯度还是比较高的，分析应有以下四点原因：1.在第一次提取酵母RNA时按照步骤规范操作，包括离心过程也进行的比较顺利，所得酵母RNA经过在通风橱中风干后才将其取出，致使纯度相对较高；2.在称取酵母RNA的时候按照分析天平的使用方法，包括调平等细节都注意到，所称得的酵母RNA质量比较准确；3.使用紫外分光光度计时操作规范，包括比色皿的干净程度等；当然实验中也不可避免的产生一些误差，分析主要有一下几点：1.酵母RNA被溶解后调PH时由于用的是PH试纸而不是PH计这种较为准确精密的仪器，所以可能会影响测定结果，造成一定的误差；2.酵母RNA溶解不是很彻底，虽然按照实验要求，并搅拌足够长的时间，但是还可以看到悬液中有少许不溶物；3.实验中的未在280nm处测定，蛋白质会对实验结果造成一定的影响。
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一、目的
学习和掌握测定RNA含量的定糖法（地衣酚法）的原理和操作技术。
二、原理
核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糖醛，后者与3，5—二羟基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收，RNA浓度在20~200微克/毫升范围内，光密度与RNA的浓度成正比关系，在反应液中如混有DNA或其他杂质。
也能给出类似的颜色。
因此测定RNA时可先测定DNA的含量，再计算RNA的含量。
地衣酚法只能测定RNA中与嘌呤连接的核糖，不同来源的RNA所含嘌呤与嘧啶的比例各不相同，因此，用所测得的核糖量来换算各种RNA的含量存在误差。
最好用被测样品相同来源的纯化RNA作RNA-核糖标准曲线，然后从曲线求得被测样品的RNA含量。
三、材料、试剂和器具
（一）试剂
1、RNA标准溶液：取酵母RNA配成200微克/毫升的标准溶液（如不溶，可滴加氢氧化铵溶液，调至pH=）
2、样品溶液：RNA浓度在20~100微克/毫升范围内。
（自己提取）
3、地衣酚试剂，先配制%三氯化铁浓盐酸溶液（A、R）。
使用前再用上述溶液为溶剂配成%的地衣酚溶液。
（临用时配制）
（二）器具
1、试管及管架
2、水浴锅
3、移液管（1，2，5ml）
4、可见光分光光度计
四、操作步骤
（一）RNA标准曲线的制作
取8支试管，编号，按下表加入试剂
加毕，摇匀，置沸水浴中加热15分钟，冷却，测值。
以值为纵坐标，RNA含量（微克/毫升）为横坐标作图绘制标准曲线。
（二）样品的测定
取~毫升样品液于试管中，加蒸馏水稀释至2毫升，后加2毫升地衣酚试剂摇匀，于沸水中煮15分钟，冷却，测。
根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度的RNA 的含量，按下式计算样品中RNA的百分含量。
RNA含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数
RNA产率（%）=含量/毫升×总体积
×100新鲜肝重（g）×106
五、注意事项
样品中蛋白质含量较高时，应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定。
六、实验报告
附上绘制标准曲线图，并计算RNA的含量及产率。
七、思考题
1、采用该法测定RNA的含量有何优点及缺点？
2、地衣酚反应中，干扰RNA测定的因素有哪些？如何能减少它们的影响？。