高级微生物

总之，基因的功能研究离不开对突变菌株的研究，同突变菌 株的研究也同样需要体外酶学分析。
基因突变可用于蛋白质与蛋白质的相互作用
有两个基因a，b，分别编 码：A蛋白与B蛋白。 基因a突变造成细胞丧失某
一功能。 如果A和B是完成这一功能所
必须的，也就是说如果A和B 之间存在相互作用，那么就 有可能在a基因的突变体中 筛选到b基因的突变，并由 于这一突变的出现，使菌体 恢复某一功能。 通过研究两者的突变位点，了解这两种蛋白的相互作用机制。
处理单细胞或单孢子悬液
使每个被处理的细胞均匀接触诱变剂，防止长出不纯菌落。因此，在诱变
时选用单核细胞：放线菌、霉菌处理分生孢子；细菌使用对数期菌体；芽 孢菌处理芽孢。
通过预实验制定最适诱变剂量
一般通过计算致死效率来确定诱变剂量。如制定诱变剂量为致死率达到 80％的诱变剂量。 物理诱变剂剂量：强度×时间，紫外线强度单位是尔格，X射线单位是伦
增，得到两个带有点突变的DNA片段，然后以得到的两个DNA片段为模板，
进行重叠PCR扩增，得到突变基因片段。
依赖于错误倾向PCR的基因突变
采用改变PCR反应体系中四种核苷酸浓度比例、镁离子浓度和使用保真性 差的DNA聚合酶等措施，增加目的基因突变率，进而获得目标基因突变的
技术。
突变菌株的筛选
突变菌株筛选的一般方法
基因突变在微生物研究 中的应用
基因突变是认识基因存在的前提
任何一个基因的都是在发现其突变体后才被证实其存在；现代分子生物学 可借助于分析DNA序列来确定基因，但是真正明确是否存在，仍然需要研 究其突变与功能的关系。
基因突变是认识基因功能的基础
lacY与细菌促进扩散： 温度敏感突变与细菌DNA复制： 筛选到许多与细菌DNA复制有关的温度敏感突 变菌株，至少可以分成十类，表明DNA复制至 少有十种蛋白。
反义RNA载体
突变菌株
突变菌株Nouthern杂交
基因的定点突变
定点突变是对DNA序列的个别核苷酸进行针对性的突变。它可以 是核苷酸的置换、插入或缺失。
依赖于PCR的基因定点突变 方法1：质粒整体PCR
以携带目的基因质粒载体为模板，设计互补的突变引物，使用高保真的 DNA聚合酶，进行长链PCR。产物经DpnI酶切处理后转化大肠杆菌菌株。
通过Southern杂交，确定突变基因，或通过构建基因文库，获得突变基因。
质粒拯救法 人工体外构建携带Tn5转座酶识别位点、抗药性基因盒和R6Kγori复制位点 区的DNA片段。其它，操作方法与“转座体法”一样。得到突变菌株后， 可以很快确定突变基因的部分序列。
携带R6Kγori复制位点的质粒复制时，需要有pir基因产物π蛋白，也就是 这样的质只能在染色体携带pir＋或pir-116的大肠杆菌菌株中复制，如
座酶，转座需要有其它元件提供转座酶，转座后稳定，不再次发生转座。
ATS转座酶：在原有的转座酶基因中发生了两个突变，造成134和249位 的半胱氨酸变成了酪氨酸，使得转座频率降低了3倍，但是转座的随机
性增强。 突变原理
携带mini-Tn10的λ噬 菌体感染受体大肠杆 菌。在诱导时，发生 转座，产生随机突变 体库。
携带人工改造转座子Tn5，其上有 荧光基因luxA和luxB；有质粒复制
位点：oriV（p15A）。
得到突变菌株后，也可以通过质粒拯救确定突变基因的部分序列。
基因的定位突变
对已知的基因进行敲除、插入、缺失和替换或进行基因融合的遗传
操作，主要用于研究已知基因的生理功能。
大肠杆菌的基因敲除：λ噬菌体Red重组酶系统
乳酸乳链球菌fabH基因的缺失突变
利用反义RNA构建突变菌株
金黄色葡萄球菌fabI突变株
表达载体：pYH4，有两个
复制子：pUC18的复制子保 证此载体能在大肠杆菌中复
制；pE194复制子保证质粒
在金黄色葡萄糖菌中复制。 该载体携带四环素抗性基因
表达调控元件，外源基因的
表达受四环素诱导。构建反 义RNA时，外源基因反向接 入多克隆位点。
突变菌株。
大肠杆菌acpP温敏突变株的筛选
错误倾向PCR
重叠PCR
其它革兰Leabharlann Baidu阴性细菌的基因敲除：pKmobsacB
自杀质粒pKmobsacB
使用ColE1的复制子oriV，携带RP4的转
移位点oriT，携带枯草芽孢杆菌的果聚糖 蔗糖酶基因sacB（负选择标记）。 该质粒能在大肠杆菌中复制，并能通过 细菌间的接合，转移进入其它革兰氏阴 性细菌，但是由于不能复制，故用于革 兰氏阴性细菌的基因敲除等操作。另外， 携带sacB基因的革兰氏阴性细菌，不能 在含有5％以上蔗糖的培养基上生长，是 一种负选择标记
操作过程 递送载体感染抑制大肠杆菌菌株，制备噬菌体裂解物。 新制备的噬菌体裂解物感染非抑制大肠杆菌受体菌，40 ℃培养。 添加IPTG，诱导转座酶表达。
筛选抗性菌株，获得随机突变体库。 设计合适的方法，获得目的突变体。
Tn5的随机突变
与Tn10类似，为复合性转座子。中心区编码卡那霉素，新霉素，链霉 素和博来霉素抗性基因，其中链霉素和博来霉素抗性基因在肠道细菌 中不表达。两侧为插入序列IS50。右侧的IS50R编码转座酶基因和转
递送载体：将mini-Tn10带入受体菌的λ噬菌体。 一般使用λb22（cI857 Oam29 Pam80）噬菌体为递送载体。特点：复制基 因O和P中各有一个琥珀无义突变（am），使得噬菌体在非抑制菌中不
能复制；cI基因为温度敏感突变cI1857，使得噬菌体DNA，在39℃不能发生
整合；mini-Tn10插入此噬菌体；转座酶基因的表达受tac启动子控制。
S17-1。
人工构建的携带R6Kγori的Tn5转座子
质粒拯救
质粒拯救
这两种方法也可用于大肠杆菌以外的细菌。
自杀性质粒的随机突变
自杀性质粒：pRL1063a 质粒的复制子为ColE1的复制子，
为狭宿主范围复制子，仅在大肠
杆菌等少数细菌中复制。携带质 粒转移识别位点oriT，通过接合可
转移到大肠杆菌以外的细菌中。
基本要求
质粒模板要求从携带DNA甲基化酶野生基因（dam）的大肠杆菌中提取。 使用一对完全互补的引物，此对引物与目的基因的特定区域能够配对； 引物长度一般为25-45bp；将要突变的位点设计在引物中间，3’端的碱
基一般为G或C。
方法2：DNA片段重叠PCR
设计2对引物，其中1对为突变互补引物。以目的基因为模板，PCR分别扩
琴或拉得等。
化学诱变剂剂量：一定温度下诱变剂浓度和处理时间。
设计高效的筛选方案
根据研究目的设计筛选方案。
化学诱变剂诱变的简便方法
在平板涂布初发菌株； 将诱变剂颗粒或沾有诱变剂
溶液的滤纸片放在平板中
央； 适合温度，保温培养一定
时间； 收集抑菌圈周围的菌体； 筛选目的突变株。
采用转座子获得基因突变
Tn10的随机突变
基因突变可用于鉴定抗菌药物物质作用的位点
利福平与依赖DNA的RNA多聚酶的β 亚单位牢固结合，抑制细菌RNA的合成，防 止该酶与DNA结合，从而阻断RNA转录过程，使DNA和蛋白的合成停止
利福平
RNA聚合酶
总之，采用基因突变可以研究微生物的生长繁殖、物质与
能量代谢及其他生命现象
获得基因突变的方法
茄科雷尔氏菌fabG基因敲除：pKmobsacB
铜绿假单胞菌acpP基因敲除：pKmobsacB
载体构建
突变菌株筛选
铜绿假单胞菌acpP基因替换：pKmobsacB
载体构建
突变菌株筛选
革兰氏阳性细菌的基因敲除：pORI280
乳酸乳链球菌 自杀性质粒：pOR280，使用乳酸菌 质粒pWV01的复制子，但是不携带 repA基因，因此，在乳酸球菌中不 复制，遗传操作只能在专用大肠杆 菌菌株EC1000中进行。该质粒携带 红霉素抗性基因，携带由乳酸菌p32 启动子控制的lacZ基因，在含有Xgal的培养基上为蓝色。 携带外源DNA片段的质粒通过电激转化进入受体菌，发生一次重组后，菌 株在平板上显蓝色，二次重组后，菌株显白色，通过PCR筛选突变菌株。
基因突变可引入生化阻断，利于阐明物质代谢途径
许多细菌的代谢途径是通过筛选突变菌株阐明的
基因突变是研究基因表达调控的主要手段之一
典型的例子就是大肠杆菌乳糖操纵子的发现和阐明
酶的体内功能需要用突变菌株来鉴定
大肠杆菌DNA复制中有三种DNA聚合酶：I，II和III。体外检测发现他 们都能催化DNA的合成。在大肠杆菌体内这三种酶的生物功能相同吗？如 何研究它们各自的生物功能？
从kan基因终止密码子TAA开始，向上游取18bp，向下游取41bp，共
59bp，做这序列的互补序列，并且头尾颠倒，得到下游引物。
这样就保证了上下游引物中有41bp的序列与lacZYA的上下游同源。使 用这对引物，以kan抗性基因为模板进行PCR扩增，得到PCR产物，使用
DpnI内切酶处理产物，并纯化。 使用电激法转化携带pKD46的大肠杆菌菌株或DY330菌株，经筛选获得
利用λ噬菌体的Red重组系统进行同源重组，达到敲除靶基因的目的。
质粒：pKD20和pKD46
复制子为温度敏感型，在42℃很容 易从宿主中丢失。 质粒携带受阿拉伯糖启动子控制的λ 噬菌体Red重组酶基因：exo、bet和
gam。在阿拉伯糖诱导时产生重组
酶，进行同源重组。
菌株：DY330
染色体上携带λ噬菌体Red重组酶基因：exo、bet和gam。为一个温度 敏感菌株
Tn10及mini-Tn10 Tn10为复合性转座子：长
9.3kb；中央区编码四环素抗
性基因；两侧为两个IS10。
转座频率为10-8 IS10两端有反向重复序列，是转座酶识别位点，中间编码转座酶，其中 IS10L中的转座酶无活性。 mini-Tn10：由IS10两端反向重复序列和中间的抗性基因组成，不编码转
DNA聚合酶I由polA编码，polA突变对细胞的生长和体内DNA合成无影响。DNA聚 合酶III由polC编码。polC的温度敏感突变菌株，在高温时不能合成DNA，并 对菌体致死。这说明DNA聚合酶I对大肠杆菌是非必需的，而聚合酶III对菌体
是必须的。后来证明聚合酶I参与DNA损伤修复，而聚合酶III参与DNA的复制。
座酶的一个抑制子，左侧的IS50L的转座酶基因无功能。
人工构建的Tn5转座子
转座体法
人工体外构建携带Tn5转座酶识别位点的抗药性基因盒（有商品出售）；
独立表达纯化Tn5转座酶（有商品出售）； 体外使转座酶与抗药性基因盒结合； 电激转化受体细菌，根据抗药性筛选转化子，得到突变体库； 根据需要，设计筛选方法，获得目的突变菌株。
大肠杆菌脂肪酸合成代谢中有两个长链酯酰ACP合成酶，均能参与长 链酯酰ACP的延伸反应，分别由fabB和fabF编码。基因突变研究发现fabF突变后， 菌体能生长；而fabB突变后，菌体为不饱和脂肪酸营养缺陷菌株。表明FabF与 FabB的生理功能不同，FabB是不饱和脂肪酸合成的关键酶。体外生物化学的研 究证明了这一点。
突变菌株富集的方法
淘汰经突变处理的微生物群体中的野生型菌体，使突变型菌株得到浓 缩，以便筛选得到突变菌株。 主要根据突变菌株和突变菌株的生长差 异，设计合理的方法，最大可能地将野生菌株杀死，保留突变菌株。
基因诱变遵循的原则
选择简便有效的诱变剂
物理诱变剂：紫外线、X射线、γ射线和快中子等。最常用是紫外线。
化学诱变剂：烷化剂、碱基类似物和吖啶类化合物。最常用的烷化剂
有N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS) 、甲基 亚硝基脲(NMU)、硫酸二乙酯(DES)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。
PCR扩增引物：以敲除大肠杆菌lacZYA为例。
首先从网上下载包含lacZYA基因上下游200bp的DNA序列，使用DNA Star编辑DNA序列，共5579bp。 用kan基因序列（从ATG到TAA，816bp）取代lacZYA（从Z的ATG到
A的TAA），得到1216bp的DNA序列。
从kan基因的ATG开始向下游取18bp，向上游取41bp，共59bp的DNA序 列为上游引物。
基因的随机突变
梯度平板筛选抗药性基因突变
微生物的自发突变率很低，在 10-5-10-10 之间。只有特殊情况时，直接 筛选自发突变的菌株。如采用梯度平板法筛选细菌抗药性突变。
诱变处理获得基因突变
利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突 变率显著提高的基础上，采用简便、快速高效的筛选方法从中挑选出少 数符合目的的突变株。