疏水作用色谱和共价色谱——高等生物分离技术

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concept
---不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之 间的疏水性作用力强弱不同，疏水性弱的物质，在较高的 离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水 性强的物质才随后被洗脱下来。疏水作用层析就是依据这 一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。疏水作用 层析的基本原理如图所示。
疏水作用色谱和共价色谱
袁辉 2014.12.30
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疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography，HIC）
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疏水作用色谱（HIC）
1. 什么是疏水色谱？ 2. 介质是什么，怎么选? 3. 影响疏水作用的因素 4. HIC的应用 5. 总结
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什么是疏水色谱？
1. Overview 2. Concept 3. Interaction principle 4. Main stages in HIC
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What is it and where is from？
Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules according to their hydrophobicity
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Water molecules Hydrophobic ligand 疏水配体
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Sample application 加样
1. Equilibration
2. Sample application
3. Washing 4. Elution
Gel matrix
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Hydrophobic groups 疏水基团
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Equilibration平衡凝胶和样品结合条件
1. Equilibration
2. Sample application 3. Washing 4. Elution
Gel matrix 基质
Equilibrate the column and adjust the sample to binding conditions 平衡色谱柱 调整样品的结合条件
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Why should I use it?
• Complementary to ion exchange (离子交换色谱，IEX) and gel filtration (凝胶色谱，GF)
• Mild, non-denaturing • High selectivity • High recovery(高回收率) • Concentrating technique（高效富集技术）
4. Elution
More strongly bound proteins 更强结合的目标蛋白的洗脱
Abs
Conc. salt
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疏水作用色谱（HIC）
1. 什么是疏水色谱？
2. 介质是什么?
Proteins
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Washing out unbound material 洗脱未结合的物质
1. Equilibration 2. Sample application
3. Washing
4. Elution
Non-bound proteins 未结合的自由蛋白
Abs吸光度
Conc. Salt 盐浓
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Elution 洗脱
（1）采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）
（2）通过往流动相中添加有机溶剂 ，如：乙二醇、丙醇 、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱 （溶剂中稳 定性良好的物质）
（3）往流动相中添加去污剂等 ，去污剂本身能与介质发 生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下来 （分离膜蛋白）
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Elution 洗脱目标物
1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing
4. Elution
Target elutes 目标蛋白的洗脱
Abs
Conc. salt
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Elution 洗脱
1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing
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overview
疏水层析分离的概念早在1948年就由Tiselius提出，但真正 发展是1970年开发出一系列适合疏水层析的固定相以后。
疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或凝胶过滤层析 等技术，使该技术与后两者经常联合使用来分离复杂的生 物样品。
目前该技术主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血 清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及 一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。
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concept
疏水色谱，又称疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离 蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白 质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团 ，称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏 水性相互作用而结合。疏水作用层析的基本原理如图所示 。
DG = DH - T DS
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Main stages in HIC 主要阶段
• Equilibrate the gel and the sample to binding conditions 平衡凝胶和样品结合条件
• Apply the sample 加样 • Wash out contaminants 除污杂物 • Elute 洗脱
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Interaction principle 作用机制
Ligands 配体
Water molecules
Gel matrix 基质
Surface exposed Hydrophobic Groups 表面疏水配基
Solute
Water moleculeHale Waihona Puke Baidu in bulk 作用后的水