酶的固定化技术
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氮化合物。活泼的叠氮基团可与酶分子中的NH2形成肽键，此外叠氮基团还可与酶分子中的 -OH、-SH等反应。R-O-CH2 –COOH +CH3OH R-O-CH2 –COOCH3 +H2O R-O-CH2 –COOCH3 +NH2-NH2 R-O-CH2 –CONH2-NH2 + CH3OH
（3）溴化氰法
对于带-OH的载体如葡萄糖、纤维素、琼脂 糖来说是最常用的反应。在碱性条件下载体 -OH和BrCN反应生成极活泼的亚氨基碳酸酯 衍生物，它们在碱性条件下可与酶的氨基进 行共价偶联反应。
OH CNBr（ 碱 性 ）
R OH
碱性
O
R O
NH +ENZ
N
O R
水
OH
O R
OH O
R O
O R
五、如何进行酶固定化
吸附法、包埋法、结合法、交联法
固定化酶的模式图
（一）吸附法
定义；利用各种固体吸附剂将酶或含酶细胞 吸附在其表面上而使酶固定的方法称为物理吸
附法，简称吸附法。
常用的吸附剂：活性炭、氧化铝、硅藻土、 多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。
▪优点：操作简便、条件温和、不易变性失活、 载体廉价、可反复使用。 ▪缺点：酶与载体结合不牢固，易脱落。
R-O-CH2 –CONH2-NH2 +HNO2 R-O-CH2 –CON3 +H2O
R-O-CH2 –CON3 +E-NH2 R-O-CH2 –CON3 +E-OH R-O-CH2 –CON3 +E-SH
R-O-CH2 –CONH-E R-O-CH2 –CO-O-E R-O-CH2 –CO-S-E
优点 条件温和、操作简便、活力损失少。 缺点 酶与载体结合不牢固，使用时需严格控
制好pH值、离子强度、温度等操作条件。
2、共价键结合法
★通过共价键使酶与载体 结合的固定化方法。 载体主要有：纤维素、 琼脂糖凝胶、葡聚糖凝 胶、甲壳质、氨基酸共 聚物、甲基丙烯醇共聚 物等。 ※载体→活化→活化载体 基团＋酶分子基团
复分批反应和装柱连续反应； ➢ 酶反应过程能够加以控制； ➢ 产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； ➢ 较游离酶更适合多酶反应； ➢ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ➢ 酶的使用效率提高，成本降低。
缺点
• 固定化时，酶活力有损失； • 工厂初始投资大； • 只能用于可溶性底物； • 胞内酶必须经过酶的分离。
天然凝胶： 琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、
包埋材料
角叉菜胶、明胶等；
合成凝胶：聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等
强度高，对温度、pH值变化耐受性强， 需要特定的聚合条件，酶易变性。
2、半透膜包埋法（微囊化法）
将酶包埋在有各种高 分子聚合物制成的小 囊中，制成固定化酶。
半透膜：聚酰胺膜、 火棉胶膜等。
适用于底物和产物都 是小分子的酶的固定 化。
（二）包埋法
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载 体中，使酶固定化的方法称为包埋法。 根据包埋的材料和包埋方法的不同，可分 为：凝胶包埋法和半透膜包埋法两类。
1、凝胶包埋法
❖将酶分子包埋在凝胶格子里。
❖凝胶包埋法用得最多、最有效，但不适用于底物或产 物分子很大的酶类的固定化。
条件温和，操作简便，对酶活 影响小，但强度差。
（2）界面聚合法： 利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合原
理包埋酶。 例：将酶和已二胺的水溶液与葵二酰氯的甲苯溶
液混合，再加SPAN乳化已二胺和葵二酰氯，在水相和 有机相的界面聚合形成包埋酶的颗粒。
（三）结合法
1、离子键结合法 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。 载体：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素。
（1）重氮法
适用于含有苯氨基的不溶性载体 载体先在稀HCl和亚硝酸钠中进行重氮反应，然后
再在温和条件下和酶分子上相应的基团如酚羟基或
咪唑基进行偶联。
Tyr含量高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性 磷酸酶、β-葡萄糖苷酶可与多种重氮化载体连接。
（2）叠氮法
含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠
R-OH+ Cl
Cl
N N
N
Cl
E-NH2
NH-E
N R-O N N
Cl
Cl
N R-O N N
Cl
（四）交联法
利用双功能试剂，在酶分子间或酶与载体间，或酶 与惰性蛋白间进行交联反应，以制备固定化酶的方 法。 交联试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。
双功能试剂：
常用的是戊二醛
O
O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
主要内容
为什么要固定化 什么叫做固定化 如何固定 固定化的酶活力测量 固定化酶的特征 固定化酶的应用
一、为什么要对酶进行固定化？
1、稳定性差 2、回收困难，一次使用 3、产物的分离纯化困难
二、什么是固定化酶
固定化酶（Immobilized enzyme） ：固定在一
定载体上，在一定空间范围内起催化作用的酶。
水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
三、固定化酶的制备原则
✓ 必须注意维持酶的催化活性及专一性 ✓ 固定化应该有利于生产自动化、连续化 ✓ 固定化酶应该有最小的空间位阻 ✓ 酶与载体必须结合牢固 ✓ 固定化酶应有最大的稳定性 ✓ 固定化酶成本要低
四、固定化酶的优缺点
优点
➢ 固定化酶可以重复，使用效率高，成本低 ➢ 极易将固定化酶与底物、产物分开； ➢ 在大多数情况下，能提高酶的稳定性； ➢ 具有一定的机械强度可以在较长时间内进行反
OH
H2N O 氨基甲酸
O 衍生物
R
OH
亚氨碳酸
O
R
NH
O
酯衍生物
NH
NH ENZ 异脲型
亚氨碳酸酯型
N ENZ
O
氨基甲酸酯型
NH ENZ
（4）烷基化法
含羟基的载体可用三氯-均三嗪、溴乙酸溴 等多卤代物活化。活化载体上的卤素基团可 与酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷基 化反应，制备固定化酶。
e.g.
制备方法：
（1）界面沉淀法： 利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶 解度极低而形成皮膜将酶包埋。 例：先将含高浓度的酶液在与水互不相溶的 有机相中乳化形成油包水的微滴,再将高聚物 加入乳化液中,然后使高聚物在油水界面沉淀 析出,形成膜,将酶包埋,最后移入水相中。 此法条件温和,酶失活少,但是要除去膜上残 留有机溶剂很麻烦。
（3）溴化氰法
对于带-OH的载体如葡萄糖、纤维素、琼脂 糖来说是最常用的反应。在碱性条件下载体 -OH和BrCN反应生成极活泼的亚氨基碳酸酯 衍生物，它们在碱性条件下可与酶的氨基进 行共价偶联反应。
OH CNBr（ 碱 性 ）
R OH
碱性
O
R O
NH +ENZ
N
O R
水
OH
O R
OH O
R O
O R
五、如何进行酶固定化
吸附法、包埋法、结合法、交联法
固定化酶的模式图
（一）吸附法
定义；利用各种固体吸附剂将酶或含酶细胞 吸附在其表面上而使酶固定的方法称为物理吸
附法，简称吸附法。
常用的吸附剂：活性炭、氧化铝、硅藻土、 多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。
▪优点：操作简便、条件温和、不易变性失活、 载体廉价、可反复使用。 ▪缺点：酶与载体结合不牢固，易脱落。
R-O-CH2 –CONH2-NH2 +HNO2 R-O-CH2 –CON3 +H2O
R-O-CH2 –CON3 +E-NH2 R-O-CH2 –CON3 +E-OH R-O-CH2 –CON3 +E-SH
R-O-CH2 –CONH-E R-O-CH2 –CO-O-E R-O-CH2 –CO-S-E
优点 条件温和、操作简便、活力损失少。 缺点 酶与载体结合不牢固，使用时需严格控
制好pH值、离子强度、温度等操作条件。
2、共价键结合法
★通过共价键使酶与载体 结合的固定化方法。 载体主要有：纤维素、 琼脂糖凝胶、葡聚糖凝 胶、甲壳质、氨基酸共 聚物、甲基丙烯醇共聚 物等。 ※载体→活化→活化载体 基团＋酶分子基团
复分批反应和装柱连续反应； ➢ 酶反应过程能够加以控制； ➢ 产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； ➢ 较游离酶更适合多酶反应； ➢ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ➢ 酶的使用效率提高，成本降低。
缺点
• 固定化时，酶活力有损失； • 工厂初始投资大； • 只能用于可溶性底物； • 胞内酶必须经过酶的分离。
天然凝胶： 琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、
包埋材料
角叉菜胶、明胶等；
合成凝胶：聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等
强度高，对温度、pH值变化耐受性强， 需要特定的聚合条件，酶易变性。
2、半透膜包埋法（微囊化法）
将酶包埋在有各种高 分子聚合物制成的小 囊中，制成固定化酶。
半透膜：聚酰胺膜、 火棉胶膜等。
适用于底物和产物都 是小分子的酶的固定 化。
（二）包埋法
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载 体中，使酶固定化的方法称为包埋法。 根据包埋的材料和包埋方法的不同，可分 为：凝胶包埋法和半透膜包埋法两类。
1、凝胶包埋法
❖将酶分子包埋在凝胶格子里。
❖凝胶包埋法用得最多、最有效，但不适用于底物或产 物分子很大的酶类的固定化。
条件温和，操作简便，对酶活 影响小，但强度差。
（2）界面聚合法： 利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合原
理包埋酶。 例：将酶和已二胺的水溶液与葵二酰氯的甲苯溶
液混合，再加SPAN乳化已二胺和葵二酰氯，在水相和 有机相的界面聚合形成包埋酶的颗粒。
（三）结合法
1、离子键结合法 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。 载体：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素。
（1）重氮法
适用于含有苯氨基的不溶性载体 载体先在稀HCl和亚硝酸钠中进行重氮反应，然后
再在温和条件下和酶分子上相应的基团如酚羟基或
咪唑基进行偶联。
Tyr含量高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性 磷酸酶、β-葡萄糖苷酶可与多种重氮化载体连接。
（2）叠氮法
含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠
R-OH+ Cl
Cl
N N
N
Cl
E-NH2
NH-E
N R-O N N
Cl
Cl
N R-O N N
Cl
（四）交联法
利用双功能试剂，在酶分子间或酶与载体间，或酶 与惰性蛋白间进行交联反应，以制备固定化酶的方 法。 交联试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。
双功能试剂：
常用的是戊二醛
O
O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
主要内容
为什么要固定化 什么叫做固定化 如何固定 固定化的酶活力测量 固定化酶的特征 固定化酶的应用
一、为什么要对酶进行固定化？
1、稳定性差 2、回收困难，一次使用 3、产物的分离纯化困难
二、什么是固定化酶
固定化酶（Immobilized enzyme） ：固定在一
定载体上，在一定空间范围内起催化作用的酶。
水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
三、固定化酶的制备原则
✓ 必须注意维持酶的催化活性及专一性 ✓ 固定化应该有利于生产自动化、连续化 ✓ 固定化酶应该有最小的空间位阻 ✓ 酶与载体必须结合牢固 ✓ 固定化酶应有最大的稳定性 ✓ 固定化酶成本要低
四、固定化酶的优缺点
优点
➢ 固定化酶可以重复，使用效率高，成本低 ➢ 极易将固定化酶与底物、产物分开； ➢ 在大多数情况下，能提高酶的稳定性； ➢ 具有一定的机械强度可以在较长时间内进行反
OH
H2N O 氨基甲酸
O 衍生物
R
OH
亚氨碳酸
O
R
NH
O
酯衍生物
NH
NH ENZ 异脲型
亚氨碳酸酯型
N ENZ
O
氨基甲酸酯型
NH ENZ
（4）烷基化法
含羟基的载体可用三氯-均三嗪、溴乙酸溴 等多卤代物活化。活化载体上的卤素基团可 与酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷基 化反应，制备固定化酶。
e.g.
制备方法：
（1）界面沉淀法： 利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶 解度极低而形成皮膜将酶包埋。 例：先将含高浓度的酶液在与水互不相溶的 有机相中乳化形成油包水的微滴,再将高聚物 加入乳化液中,然后使高聚物在油水界面沉淀 析出,形成膜,将酶包埋,最后移入水相中。 此法条件温和,酶失活少,但是要除去膜上残 留有机溶剂很麻烦。