荚膜多糖解聚酶终结版

噬菌体诱导的荚膜多糖解聚酶的催化和分子特性

综述

从污水中分离出的噬菌体侵染产气杆菌会激活多糖解聚酶的合成启动，水解宿主的荚膜多糖。这种酶以两种形式存在，溶解态和噬菌体结合态。经圆盘凝胶电泳和分子筛层析技术提纯，溶解态酶实为同一种，并且具有以下分子特性：（a）沉降系数为10.7S；（b）斯托克斯半径为86.2A；（c）分子质量为379,000；（d）摩擦比率1.77。在42-62℃条件下用十二烷基硫酸钠处理解聚酶可得到两个不同的亚基，分子质量分别为63,200和36,400。

解聚酶有高度特异的溶菌酶性质，随机攻击荚膜多糖中的半乳糖基-α-1→3-半乳糖键，该键是高聚物中四糖重复单元的一个易受攻击键。通过解离基团的释放可以很方便地测定这种解聚酶的活性；这种酶最适宜pH为5.2。用NaIO4和NaBH4作用于荚膜多糖，可以有选择性的降解其葡萄糖醛酸支链；得到的多糖的降解速度低于未被处理的荚膜多糖的降解速度的1%。可被解聚酶降解的最小寡糖是一种十二糖，称为C，由三个四糖重复单元构成。解离的寡糖C的降解速度为荚膜多糖降解速度的1%，此过程具有高度特异性；只对于半乳糖基半乳糖键直接结合在末端、未解离的四糖重复单元才能发挥作用。

噬菌体结合态的解聚酶和溶解态的解聚酶催化特性相同。无论是用8M的尿素还是4M的盐酸胍来处理噬菌体都会引起与噬菌体结合态的解聚酶活性的定量溶解。而这样溶解下来的酶不易通过葡聚糖G-200凝胶柱色谱法与那些原来从细胞裂解物分离出的可溶酶区分开。.

正文

噬菌体侵染带荚膜的细菌有一个共同的特征，那就是能够诱导一系列降解宿主荚膜（或有粘性）多糖的酶。这些酶，通常称为多糖解聚酶，已经在一些噬菌体宿主细胞系统(Z-7)中被检测到。然而，关于这些酶分子的特性的信息还十分欠缺。现在只有一个研究报告是关于其中一种多糖解聚酶已被分离提纯测定具有明显的均一性（PS:纯度较高）。另外，虽然早已证实这些酶属于内切水解酶，通常只作用于宿主的胞外多糖，但是它们的作用模式大多数了解的不是很清楚，因为相关的研究都是在不清楚具体的胞外多糖底物结构的前提下展开的。但其中也有例外，噬菌体诱导的作用于产气克雷伯氏菌A3(Sl)(type54)粘液多糖的多糖解聚酶在研究（9,10）中已经弄清楚了它的结构特征。这些酶中有的已经被分离出来，并专一性切割粘性多糖的岩藻糖基葡萄糖键(11,12)。

前面描述的一个产气杆菌菌株可以产生一种荚膜多糖，这种多糖是由半乳糖，甘露糖和葡萄糖醛酸以2:1:1的比例构成的。经过分析荚膜多糖的结构可以发现它是由一个具有以下结构的四糖重复单元组成的线性序列构成。

这株产气杆菌的烈性噬菌体已经被分离出来，并且被证明其具有诱导产生多糖解聚酶以降解荚膜多糖的能力。这种酶被证明是一种溶菌酶，专一性切割荚膜多糖中的半乳糖基半乳糖键。这篇报道介绍了噬菌体诱导酶的纯化过程和分子特性。此外，对于这种酶的催化特性也有进一步的研究。

实验步骤

菌体和生长条件：该研究用到的产气杆菌是由该学校微生物学系提供的。菌株在固体培养基的生长产生了一些高粘性的菌落，这是由于大量的荚膜多糖存在的缘故。

在含有（U-14C）作为唯一碳源的合成培养基中培养时，大约30%的放射性被认为作为荚膜多糖的形式存在的。关于这种多糖的具体的结构描述可以在伴随的文献（15）中查到。对于多糖解聚酶的产生，产气杆菌一般在化学成分设定好的培养基上培养，化学组成如下（g/L）：(NH2)2SO4,10;Na2HPO4,10;KH2PO4,3;K2SO4,1;NaCl,1;MgSO4·7H2O,0.2

CaCl2·2H2O,0.014;FeSO4·7H2O,0.001;酪蛋白氨基酸，0.5；葡萄糖，10。

葡萄糖备成50%的溶液，分开灭菌，并且在无菌条件下加入到灭菌后的盐溶液中。微生物在New Brunswick发酵罐中30℃、机械搅拌、强制通气条件下生长。

产气杆菌的保存培养在-15℃下含有15%甘油的大豆胰蛋白胨培养液中进行，含有1mL菌体悬浊液的样品瓶置于大豆胰蛋白胨培养液中过夜，并在含有2%琼脂的同种培养基上平板培养。分离得到粘性单菌落并接种到培养基上用于进一步研究。

噬菌体---产气杆菌的烈性噬菌体按照以下方法分离：

25mL污水原样通过细菌过滤器澄清，然后加入到含有5mL5倍浓缩的大豆胰蛋白胨培养液（15g/mL）的烧瓶中接种以1mL对数生长期的产气杆菌。37℃下摇床培养5h后，离心去除细胞，上清液等分为10mL每份，并用6%的无菌大豆胰蛋白胨培养液稀释至20mL，接种以1mL对数生长期的产气杆菌。37℃下培养2h发生彻底裂解。裂解液进行适当的稀释，并与产气杆菌利用软琼脂层方法（16）倒平板。尽管大部分菌落形态学特征体现为环绕裂解透明区域的半透明、凹陷型晕圈，我们还是观察到了几种噬菌斑（如图一）。这种噬菌斑是由侵染了宿主细胞的、可以诱导多糖解聚酶合成的噬菌体特异性形成的(2,4,6,17)。在这篇文章的剩余部分会介绍一种称为K-2的噬菌体，并且利用Adams（16）的方法不断地进行单噬菌斑分离使之得到纯化。

用于制备噬菌体K-2、多糖解聚酶或者培养液的细胞裂解物用下列方法制成：9000mL 的合成培养基接种以1000mL产气杆菌的过夜培养液。在37℃下培养75-85min后，以感染复数为1/25的比例添加噬菌体K-2，继续进行培养；通常2h内可以完成裂解（如图2）。裂解液迅速降温至4℃，并通过离心出去细胞碎屑。

纯化的噬菌体悬浮液通过下述方法制得：硫酸铵固体（50g/100mL）加入到细胞裂解液中；生成的沉淀溶解于T2缓冲液中（见下面），并且在9000×g转速下离心30min以移除不溶性物质。前步所得上清液在78800×g转速下离心，移除上清液，沉淀物悬浮于T2缓冲液。4.5mL噬菌体悬浮粗提液中加入2.4gCaCl2，悬浮液利用Beckman SW离心机在39000rpm下离心至平衡（36h）。噬菌体在接近离心管底部的窄带中浓缩，可以通过刺穿管底进行收集，并注意使组分从管内逐滴流出。噬菌体在T2缓冲液中4℃下保存，T2缓冲液组成如下（g/L）：Na2HPO4, 3.0;KH2PO4, 1.5;NaCl, 4.0;K2S04, 5.0;CaCl2.6H2O, 0.02;MgS04.7H2O,0.2.如果悬浮液浓度达1010噬菌体/mL，那么噬菌体浓度可保持稳定达1年。

密度变化实验---产气杆菌的培养是在缺乏酪蛋白氨基酸的合成培养基上进行的：在重密度的培养基中，利用D2O替换了97%的H2O，20mL培养液置于125mL烧瓶中在37℃摇床上培养至菌密度为大约70Klett单位。然后将细胞置于7000×g转速下离心6min，再置于与原来培养液密度不同的培养基中悬浮培养。迅速以感染复数为2的比例加入噬菌体K-2，条件不变继续培养至细胞裂解完全。每份裂解物迅速冷却至4℃。

噬菌体和细胞碎屑通过78000×g离心2h从裂解物中去除。上清液加入硫酸铵（4.75 g/l0mL）混合，并在4℃下搅拌30min。沉淀物在0.25ml10mM Tris（pH7.1）中溶解,利用1000倍体积的相同缓冲液进行透析100min。等密度平衡离心之前，每份0.15mL的透析样品混合以3.35mL10mM的Tris缓冲液（pH7.1），注意缓冲液中含有36pg的过氧化氢酶（内