大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

实验六
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
PCR
质粒基DNA 提取和酶切
因工程连接的基本本路转化
路线
实验目的
掌握氯化钙法制备与转化感受态细胞的原理、方法和技术。

学会对质粒转化结果的评估。

实验原理
转化(Transformation)
是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生种短暂的感受态以摄取外源DNA。

细胞经过些特殊方生一种短暂的感受态以摄取外源DNA细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl
法等处理后，细胞膜的通透性发生了
2
暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感暂时性的改变成为能允许外源DNA分子进入的细胞即感受态细胞(Compenent cells)。

0.1mol/L CaCl
是一种低渗溶液,在0℃冷冻处理大肠
2
杆菌细胞时,细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。

在短杆菌细胞时细胞膨胀成球形DNA可吸附在其表面在短暂的热冲击下，细胞可吸收外源DNA。

摄入了外援DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖，表达外源基因。

带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基区分开来
转化子在选择培养基上区分开来。

Amp r：抗氨苄青霉素–β内酰胺酶
多克隆位点：外源DNA片段的插入位点
Amp s菌株
培养基上含有X-Gal和
Amp r IPTG时，可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正的重组的转化子。

涂布于含的培养基上可以生长
Amp的培养基上，可以生长。

次日可见白色菌落--转化子。

蓝白斑筛选的原理（α-互补）
蓝白斑筛选的原理（α-互补）
现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有现在使用的许多载体都带有个大肠杆菌的的短区段其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。

在
这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。

因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。

这种现象称为α-互补。

由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。

然而，当外源DNA插入到X Gal存在时产生蓝色菌落因而易于识别然而当外源
质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。

这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。

如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板37℃温箱倒置培养白斑筛选如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板
12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。

材料、设备及试剂
材料
E. coli DH5α菌株: R-、M-、Amp-(转化过程所用的受体细
胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进和基化酶的突变体()它以容忍外源
入体内并稳定地遗传给后代。

）
UC19（浓度10/l)
pUC19质粒DNA（浓度：10ng/μl): 购买或实验室自制
设备恒温摇床电热恒温培养箱台式高速离机无菌设备：恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；无菌工作台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。

试剂
1、LB固体和液体培养基
LB培养基配方：（单位g/L）
胰蛋白胨
10
酵母提取物5
NaCl 10
NaCl10
琼脂（1.5%）15g （注：LB培养液不加琼脂）
O后置电炉上加热熔解琼脂，按配方称量药品加入定量的后置电炉上加热熔解琼脂
,加入一定量的ddH
2
待琼脂完全熔解后加入ddH
O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。

2
121℃湿热高压灭菌2030分钟，待冷却至60℃左右,在超静工作台
20-30分钟待冷却至
中加入一定量的Amp储存液,使终浓度为100μg/ml,摇匀后用培养皿铺板。

2、Amp母液：
100mg溶于1mlddH
O中，0.22μm滤器称取氨苄青霉素1001ldd中022
2
过滤除菌，用EP管分装后储存于-20℃冰箱.
溶液:
3、0.1mol/L CaCl
01mol/L CaCl
2
称0.56gCaCl
(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容
2
至100ml,用0.22μm滤器过滤除菌or高压灭菌。

EP管分装100ml022μm
于0℃冰箱储存.
标准p质粒浓度g
4、标准pUC19质粒：浓度10ng/μl
操作步骤
（一）受体菌的培养
1、－70℃或－20℃低温冰箱取出菌种后，在LB培养液中培养过夜，进
或低温冰箱取出菌种后在培养液中培养过夜进行活化;
2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布,于
37℃培养箱中培养24h；从LB平板上挑取单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。

37℃直至对数生长后期
3、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于LB液体培养基中,37℃振荡培
养2-3小时至OD
2305生长对数期）（注这一步非常关键
＝0.5左右(生长对数期）。

（注：这一步非常关键。

600
培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援能力较低，从而导致转化率降低）
DNA能力较低，从而导致转化率降低。

）
（二）、感受态细胞的制备( CaCl
法)
2
1、将1.5ml菌液移入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下
5000rpm离心5分钟。

2、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，并用吸水纸或移液器移除残余
弃去清轻轻倾倒掉清液并用吸水纸或移液器移除残余的过多水分）。

3、加入1ml预冷的0. 1mol/L的CaCl
溶液，轻轻拨动管底使细胞完
0.1mol/L
2
全悬浮,冰上放置15分钟后,4℃下5000rpm离心5分钟。

3、弃去上清,加入0.2ml预冷的0. 1mol/L的CaCl
溶液,轻轻悬浮
02ml01mol/L
2
细胞，即制成感受态细胞。

将感受态细胞悬液分装成2份，每份100μl（注意悬液密度要均匀）。

冰上放置备用。

4、暂时不用的感受态细胞可置于-80℃保存。

处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！
注：CaCl
注C Cl处理后的细胞比较脆弱尽量温柔操作！
2
（三）质粒pUC19的转化
1.质粒和感受态细胞混和：分别在100μl感受态细胞悬液中加入下
列DNA质粒或水，轻轻摇匀后冰上放置30分钟。

感受态细胞+ pUC19质粒2μl (含量不超过50ng,体积不超过10μl)
感受态细胞+无菌水2μl （阴性对照）
2.热击：42℃水浴中热击90秒（
热击：℃水浴中热击秒（注：精确计算时间，过长将对细胞造成伤害）,热击后立即置于冰上冷2-5分钟（禁止摇动）。

3.复苏：向每管中加入400μl LB液体培养基(注：不含Amp),混匀
复苏：向每管中加入400μl LB液体培养基(
后37℃轻摇培养1~1.5小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp r)。

（四）涂布平板筛选转化质粒
1.将上述3管培养液摇匀后取50μl 涂布于含Amp的筛选平板上。

将上述管培养液摇匀后取涂布于含的筛选平板上
（注：1. 将培养液摇匀后涂布；2.为了便于计算转化率，必须获得分散的、独立的菌落用于计数。

所以涂布时尽量将50μl的培养液均匀涂布于培养基的表面，使之尽量分散。

）
2. 正面向上放置15分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培2正面向上放置15分钟待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿37℃培养过夜。

（五）次日（12-14小时后）观察和计算转化率：观察记录转化情况并统计转化率。

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝该皿的菌落数×稀释倍数
（注：稀释倍数= 转化反应原液总体积／涂板菌液体积）
转化频率＝转化子总数／质粒DNA加入量(μg)
（注：理想值可达5×106～2×107转化子/ μg DNA）
预期实验结果
实验报告（3）
计算转化率并根据转化率和阴性对照分析实验结果。

思考题
(1). 根据本实验你认为影响转化率的因素有哪些？
(2). 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，
你将如何解释这种现象？
实验中要考虑的重要因素
提高转率实验中考虑个
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度:不要用经过多次继代或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培
来控制057养液的OD 600来控制。

DH5α菌株的OD 600 为0.5时,细胞密度在5×107
个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。

密度过高或不足均会影响转化效率。

足均会影响转化效率
2. 质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态
DNA(cccDNA)。

转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当
加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。

1ng的
A转化效率就会降低1
cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。

一般情况下,DNA溶液的
体积不应超过感受态细胞体积的5％。

等均需是最高纯度的(GR.或AR.), 3. 试剂的质量:所用的试剂,如CaCl
2
并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。

最好分装保存于干燥的冷暗处
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：严格来说，整个操作过程均应在无菌条件
下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处
tip
理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污
染,则均会影转化效率或杂转,为后筛定带, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带
来不必要的麻烦。

下次试验:植物总RNA的提取(P150)
9预习提取RNA的原理和防止RNA酶污染的方法9准备试验材料：幼嫩的植物叶片。