大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

实验六

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

PCR

质粒基DNA 提取和酶切

因工程连接的基本本路转化

路线

实验目的

掌握氯化钙法制备与转化感受态细胞的原理、方法和技术。 学会对质粒转化结果的评估。

实验原理

转化(Transformation)

是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生种短暂的感受态以摄取外源DNA。细胞经过些特殊方生一种短暂的感受态以摄取外源DNA细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl

法等处理后，细胞膜的通透性发生了

2

暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感暂时性的改变成为能允许外源DNA分子进入的细胞即感受态细胞(Compenent cells)。

0.1mol/L CaCl

是一种低渗溶液,在0℃冷冻处理大肠

2

杆菌细胞时,细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短杆菌细胞时细胞膨胀成球形DNA可吸附在其表面在短暂的热冲击下，细胞可吸收外源DNA。

摄入了外援DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖，表达外源基因。带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基区分开来

转化子在选择培养基上区分开来。

Amp r：抗氨苄青霉素–β内酰胺酶

多克隆位点：外源DNA片段的插入位点

Amp s菌株

培养基上含有X-Gal和

Amp r IPTG时，可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正的重组的转化子。

涂布于含的培养基上可以生长

Amp的培养基上，可以生长。次日可见白色菌落--转化子。

蓝白斑筛选的原理（α-互补）

蓝白斑筛选的原理（α-互补）

现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有现在使用的许多载体都带有个大肠杆菌的的短区段其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在

这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为α-互补。

由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到X Gal存在时产生蓝色菌落因而易于识别然而当外源

质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板37℃温箱倒置培养白斑筛选如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板

12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。

材料、设备及试剂

材料

E. coli DH5α菌株: R-、M-、Amp-(转化过程所用的受体细

胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进和基化酶的突变体()它以容忍外源

入体内并稳定地遗传给后代。）

UC19（浓度10/l)

pUC19质粒DNA（浓度：10ng/μl): 购买或实验室自制

设备恒温摇床电热恒温培养箱台式高速离机无菌设备：恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；无菌工作台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。

试剂

1、LB固体和液体培养基

LB培养基配方：（单位g/L）

胰蛋白胨

10

酵母提取物5

NaCl 10

NaCl10

琼脂（1.5%）15g （注：LB培养液不加琼脂）

O后置电炉上加热熔解琼脂，按配方称量药品加入定量的后置电炉上加热熔解琼脂

,加入一定量的ddH

2

待琼脂完全熔解后加入ddH

O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。

2

121℃湿热高压灭菌2030分钟，待冷却至60℃左右,在超静工作台

20-30分钟待冷却至

中加入一定量的Amp储存液,使终浓度为100μg/ml,摇匀后用培养皿铺板。

2、Amp母液：

100mg溶于1mlddH

O中，0.22μm滤器称取氨苄青霉素1001ldd中022

2

过滤除菌，用EP管分装后储存于-20℃冰箱.

溶液:

3、0.1mol/L CaCl

01mol/L CaCl

2

称0.56gCaCl

(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容

2

至100ml,用0.22μm滤器过滤除菌or高压灭菌。EP管分装100ml022μm

于0℃冰箱储存.

标准p质粒浓度g

4、标准pUC19质粒：浓度10ng/μl

操作步骤

（一）受体菌的培养

1、－70℃或－20℃低温冰箱取出菌种后，在LB培养液中培养过夜，进

或低温冰箱取出菌种后在培养液中培养过夜进行活化;

2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布,于

37℃培养箱中培养24h；从LB平板上挑取单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。

37℃直至对数生长后期

3、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于LB液体培养基中,37℃振荡培

养2-3小时至OD

2305生长对数期）（注这一步非常关键

＝0.5左右(生长对数期）。（注：这一步非常关键。

600

培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援能力较低，从而导致转化率降低）

DNA能力较低，从而导致转化率降低。）